SMC^®アッセイのステップごとのガイド

このステップごとのガイドでは、SMC^® Human IL-6 High Sensitivity Immunoassay Kitを例に、SMC^®アッセイを実施する方法を開始から終了まで説明します。スタンダードの溶解、標準曲線の作成、ビーズと検出抗体の調製と分注、溶出と中和までの各ステップに関する動画も視聴できます。

• スタンダードの溶解方法
• 標準曲線の作成方法
• ビーズの調製・分注方法
• 検出抗体の調製・分注方法
• 溶出・中和ステップの実施方法
• 関連製品

スタンダードの溶解方法

以下に、SMC^® IL-6アッセイのスタンダードを溶解するための手順を示します。

• ホイルとシールをはがし、ゴム栓をゆるめます
• このゴム栓はバイアルから外さないように注意してください
• IL-6凍結乾燥スタンダードを250 µLの超純水で溶解します
• 数回バイアルを転倒混和します
• バイアルを5～10分間静置します

これらのステップをまとめた動画も視聴できます。

標準曲線の作成方法

以下に、SMC^® IL-6アッセイの標準曲線を作成する手順の概要を示します。

Standard Diluentの分注

• 12チャネルリザーバーのウェル2～5に、Standard Diluentを1,000 µLずつ添加します
• 次に、ウェル6～12にStandard Diluent を500 µLずつ添加します

標準曲線用の連続希釈液の調製

• IL-6スタンダードバイアルの開始濃度については、分析証明書の基準値を参照してください
• IL-6スタンダードストックを50 pg/mLになるように、少なくとも1 mLの最終溶量で希釈します
• 50 pg/mLのスタンダードストック1 mLを12チャンネルリザーバーのウェル1に添加します
• ウェル1から500 µLをウェル2に移し、十分に混合します
• 連続希釈をウェル2からウェル11まで行い、都度十分にむらなく混合します
• ウェル12には何も添加せず混合します

サンプルおよびスタンダードのアッセイプレートへの分注

• 各スタンダード75 µLをアッセイプレートの対応するウェルにピペットで添加します
• サンプル75 µLをアッセイプレートの対応するウェルにピペットで添加します

以上の各ステップの操作はこの動画でも確認できます。

ビーズの調製・分注方法

以下に、SMC^® IL-6アッセイのビーズの調製と分注の手順を示します。

キャプチャ抗体ビーズの調製

• IL-6キャプチャ抗体ビーズを、ローテーター（rotisserie-style mixer）で、すべてのビーズが懸濁するまで混合します（推奨時間は30分以上）
• 次に、ビーズバイアルの全量を11.0 mLのAssay Bufferに添加します
• ビーズバイアルを0.55 mLのAssay Bufferでリンスして加え、すべてのビーズを回収します
• 穏やかに転倒混和します
• アッセイプレートに分注するため、ビーズをリザーバーへ分注します

キャプチャ抗体ビーズのアッセイプレートへの分注

• 希釈したビーズをアッセイプレートに1ウェルあたり100 µLずつピペットで分注します
• 各分注操作の間にピペットを用いてビーズを再懸濁します

キャプチャインキュベーション

• アッセイプレートを透明な粘着プレートシールを用いてシールします
• シールをしっかり押さえて密閉し、漏れや交差汚染を防ぎます
• オービタルマイクロプレートインキュベーター／シェーカー（例：Boekel Scientific Jitterbug^™ Shaker）において25℃で2時間インキュベートします
• アッセイキットプロトコルに記載されている推奨振とう速度に従ってください
• 攪拌は25℃で2時間行います

この動画で各ステップを確認できます。

検出抗体の調製・分注方法

以下に、SMC^® IL-6アッセイの検出抗体の調製と分注の手順を示します。

• SMC^® ／MILLIPLEX^® アッセイ用BioTek^® 405^™TSUVSプレートウォッシャー （カタログ番号 95-0004-06）の場合：
  • プレートをマニホールド上にセットします
  • 洗浄プログラムの「Post Capture Wash」を選択します
  • 「Run」をクリックします

検出抗体の調製方法

• 1x検出抗体の調製： 250 µLの20S検出抗体を4,750 µLのAssay Bufferに添加します
• 希釈液を転倒混和します
• 0.2 µmフィルター付きシリンジで希釈した検出抗体をろ過し、リザーバーに入れます

検出抗体をアッセイプレートに分注します

• プレートウォッシャーからプレートを取り外した後、検出抗体を1ウェルあたり20 µLずつ分注します
• アッセイプレートを透明な粘着プレートシールでしっかりとシールします
• オービタルマイクロプレートインキュベーター／シェーカー（例：Boekel Scientific Jitterbug^™ Shaker）においてプレートを25℃の暗所で1時間インキュベートします
• アッセイキットプロトコルに記載されている推奨振とう速度に従ってください
• 攪拌は25℃で1時間行います

検出抗体の調製および分注方法はこの動画をご覧ください。

溶出・中和ステップの実施方法

以下に、SMC^® IL-6アッセイの溶出と中和の手順を示します。溶出と中和のステップはキットごとに異なる可能性があるため、キットプロトコルに従うようにしてください。

検出洗浄1

• SMC^® ／MILLIPLEX^® アッセイ用BioTek^® 405^™TSUVSプレートウォッシャー  （カタログ番号 95-0004-06）：
  • プレートをマニホールド上にセットします
  • 洗浄プログラム「4 Cycle Pre-Transfer」を選択します
  • 「Run」をクリックします

検出洗浄インキュベーション後

• アッセイプレートを透明な粘着プレートシールで密封し、シールをしっかり押さえて密閉し、漏れや交差汚染を防ぎます
• プレートをマイクロプレート／インキュベーターシェーカーに置き、アッセイキットプロトコルに記載されている推奨振とう速度・時間に従ってください
• プレートをマイクロプレート／インキュベーターシェーカーから取り出し、飛び散らないように気を付けて透明粘着プレートシールを取り外し、プレートをプレートウォッシャーの上において最終吸引を実施します

検出洗浄2

• SMC^® ／MILLIPLEX^® アッセイ用BioTek^® 405™TSUVSプレートウォッシャー  （カタログ番号 95-0004-06）：
  • プレートをマニホールド上に再びセットします
  • 洗浄プログラム「Final aspiration」を選択します
  • 「Run」をクリックします

Buffer Bの分注

• プレートウォッシャーからプレートを取り外した後、Buffer Bを1ウェルあたり11 µLずつ分注します
• アッセイプレートを透明な粘着プレートシールを用いてシールします

溶出インキュベーション

• オービタルマイクロプレートインキュベーター／シェーカー（例：Boekel Scientific Jitterbug^™ Shaker）において25℃で10分間インキュベートします
• アッセイキットプロトコルに記載されている推奨振とう速度に従ってください 
• 攪拌は25℃で10分間行います

Buffer Dの分注

• 新しい96ウェルアッセイプレートにBuffer Dを1ウェルあたり11 µL添加します
• アッセイプレートを透明な粘着プレートシールを用いてシールします

2枚目の96ウェルプレートに溶出液を分注

• アッセイプレートをSMC^®マグネット上にセットします
• 室温で2分間静置して、ビーズが沈降し、ペレットを形成できるようにします
• ウェルの端に赤い点のように見えるビーズペレットが形成されます
• アッセイプレートの溶出液10 µLをプレートのV底から直接吸引して、先の手順でBuffer Dを添加した96ウェルプレートに移します
• ビーズペレットには触れないようにします
• 操作ごとにチップを交換してください

最終攪拌ステップ

• プレートを透明粘着プレートシールで密封します
• オービタルマイクロプレートインキュベーター／シェーカー（例：Boekel Scientific Jitterbug™ Shaker）において25℃で2分間インキュベートします
• アッセイキットプロトコルに記載されている推奨振とう速度に従ってください 
• 攪拌は25℃で2分間行います
• プレートを1,100 xgで1分間遠心分離します

384ウェルプレートに中和溶出液を分注します

• 384ウェルプレートのQuadrantの使用手順を確認します
• ゆっくりと透明粘着シールを取り外し、ウェルあたり20 µLの中和溶出液を、同梱のプレートホルダー上に設置した SMC^® 読み取りプレートの対応するウェルに移します。

プレート読み取り前

• 読み取りプレートを透明な粘着プレートシールでシールします
• プレートを約1,100 xgで室温で1分間遠心分離します
• プレートシールをはがし、読み取りプレートのウェルを確認し、気泡がある場合は除去します

プレートの読み取り

• アルミ粘着シールでSMC^® 読み取りプレートをしっかりと密封します
• 推奨のプレートローラーを使って力を入れて密封します（技術資料「SMC^® 読み取りプレートのシール方法」でコツをご覧ください）
• 密封したSMC^® 読み取りプレートからプレートホルダーを取り外し、プレートをSMCxPRO^® システムに装着して読み取ります

SMC^®プロトコルの主な溶出および中和ステップについては、この動画をご覧ください。

SMC^® テクノロジーの詳細については、技術資料 「高感度イムノアッセイ技術の概要」 をご覧いただくか、技術資料「 SMC^® Tips & Tricks」で専門家のアドバイスをご確認ください。