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ホームLuminex®用MILLIPLEX®マルチプレックスアッセイヒントとコツ：MILLIPLEX® サイトカインマルチプレックスパネルにおける代替サンプルタイプ

ヒントとコツ：MILLIPLEX® サイトカインマルチプレックスパネルにおける代替サンプルタイプ

セクションの概要

マイオカインの多様な系は、さまざまなシグナル伝達経路に関与しています。MILLIPLEX® Human Myokine Panelのようなマルチプレックスマイオカインイムノアッセイにより、研究者は複数の筋分泌因子を同時に測定することができ、関連する疾患についてより多くの知見を得ることができます。

マイオカインとは？

骨格筋は、「マイオカイン」と総称される多くのタンパク質の合成・分泌に活発に関与しています。1 マイオカインは、図1に示すように、オートクラインおよび／またはパラクラインとして作用し、骨格筋の代謝、増殖、分化（筋成長）を制御します。

 

マイオカインシグナル伝達経路を示す図。骨格筋から分泌されるマイオカインは、肝臓、膵臓、骨、循環器など多様な臓器にシグナルを送る。血管新生が上方制御される正確なメカニズムは現在も研究されている。Pedersen BK, Febbraio MA.より引用。Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ.Nat Rev Endocrinol. 2012 Apr 3; 8(8): 457 – 65.

図1.骨格筋から分泌されるマイオカインは、肝臓、膵臓、骨、循環器など多様な臓器にシグナルを送る。血管新生が上方制御される正確なメカニズムは現在も研究されている。Pedersen BK, Febbraio MA.より引用。Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ.Nat Rev Endocrinol. 2012 Apr 3; 8(8): 457 – 65.1

マイオカインは、内分泌ホルモンとしても作用し、細胞代謝、内皮機能、腫瘍増殖／抑制を変化させます。これらのマイオカインは、心臓、脂肪組織、乳房、結腸、肝臓、腸、内皮、骨、骨格筋など、さまざまな組織における炎症反応にも関与しています。運動による抗炎症作用、抗病作用は、これらのマイオカインによって介在されている可能性があり、マイオカインのシグナル伝達経路は、自然免疫、神経シグナル伝達、インスリン反応と交差しているという事実が新たに支持されています。2,3

また、骨格筋の機能・量の低下が進行するサルコペニアは、老化の重大な特徴であり、機能低下やせん妄などの老年症候群の主要な構成要素です。筋由来の成長因子やサイトカイン、つまりマイオカインが加齢性疾患の進行を調節し、全身性老化の根底にある組織間コミュニケーションに寄与することを示すエビデンスが多く報告されています。

マイオカインマルチプレックス解析

前臨床試験やトランスレーショナルリサーチにおいて、マイオカイン定量の必要性が高まっているため、この研究におけるマルチプレックスイムノアッセイも必要になってきています。マイオカインのマルチプレックス解析により、研究者は複数のマイオカインを同時に測定することができます。例えば、MILLIPLEX® Human Myokine Panel は、表1に示された血清または血漿中のアナライトの一部または全部を同時に定量するための15プレックスキットです。

 

略称アナライト機能
APLNApelinApelinの機能は、発現している組織によって異なる。Apelinは、血管組織では血圧を、心筋組織では心臓の収縮を、脳では食物や水分の摂取を、消化管ではグルコースの取り込みやインスリンの抑制を制御。
BDNFBrain-derived neurotrophic factor長期記憶に関連。BDNFの分泌は運動に応答して増加。
EPOErythropoietin赤血球の産生を促進することから、スポーツ選手に投与して体内の酸素供給量を増やし、表面上のパフォーマンスを向上させることがある。
FABP3Fatty acid-binding protein 3心筋組織で産生され、長鎖脂肪酸の心臓への取り込みを制御するマイオカイン。心筋梗塞や急性冠動脈イベントの信頼性の高い早期バイオマーカー。
FGF-21Fibroblast growth factor 21FGF-21は、Aktによって活性化される代謝調節ホルモン（マイオカイン）。
該当なしIrisinFNDC5（Fibronectin type III domain-containing protein 5）の切断・分泌部位－かつて議論されたIrisinの機能は、タンデム質量分析を用いたプロテオミクス研究により決定された。4 Irisinレベルは運動に応答して増加し、白色脂肪の褐色化に関与する可能性がある。
FSTL1Follistatin-related protein 1一酸化窒素シグナル伝達によって制御されるFSTL1は、筋肉の新しい血管の形成を誘導し、虚血誘発性アポトーシスから心筋細胞を保護する。
CX3CLFractalkineCX3CL1は、単球、ナチュラルキラー細胞、T細胞、平滑筋細胞に発現するケモカインタンパク質。近年、肥満、インスリン抵抗性糖尿病、2型糖尿病との関連性が指摘されている。
IL-6Interleukin 6IL-6は、ある意味「マスターマイオカイン」で、グルコース産生、脂肪酸化、脂肪分解など、運動に応答して多様なプロセスを制御。また、IL-6は運動に対する免疫応答を制御し、抗炎症性シグナル伝達を誘発する。
IL-15Interleukin 15IL-15は、T細胞やNK細胞の活性化および増殖を制御。マイオカインとして、内臓脂肪を有意に減少させる。
LIFLeukemia inhibitory factorこのタンパク質は分化を抑制し、運動に応答して心筋幹細胞や筋幹細胞を活性化する可能性がある。
GDF8Growth differentiation factor 8 (Myostatin)Myostatinはフィードバックループにより、筋肉細胞の増殖を抑制し、幹細胞が筋肉系に分化するのを阻害する。
OSMOncostatin MOncostatinは、IL-6サイトカインファミリーに属し、IL-6と同じ機能、特に炎症の制御を行う可能性が高いと考えられる。
OSTNOsteocrin (Musclin)Musclinの主な役割は、グルコース代謝の調節である。
SPARCSecreted protein acidic and rich in cysteine (Osteonectin)SPARCは、運動に応答してアポトーシスを誘導することで、大腸の腫瘍の進行を阻害するマイオカイン。

表1.MILLIPLEX® Human Myokine Panelに含まれるアナライトとその生物学的機能

方法

MILLIPLEX® Human Myokine Magnetic Bead Panelを用いて、血清・血漿サンプルおよびアッセイキットに含まれるスタンダードを用いてマルチプレックスアッセイを行いました。付属のプロトコルの説明に従って実施しました。キャプチャ抗体結合ビーズとサンプルをインキュベートし、ビーズ上のキャプチャ抗体とアナライトが結合します。ビオチン化検出抗体を添加し、検出抗体がアナライトと結合することで、サンドイッチを形成します。Streptavidin-phycoerythrin（SA-PE）色素を添加し、色素がサンドイッチに結合して蛍光を発します。

マルチプレックス解析結果

Serum Matrixで段階希釈した各アナライトのスタンダードを用いて、アッセイ応答（アナライト濃度に対する平均蛍光強度［MFI］）を決定するための標準曲線を作成しました。標準曲線は、すべてのアナライトに対して3～5オーダーの直線的なMFI値を示すことが確認されました（図2）。

 

MILLIPLEX® Human Myokine Panelの標準曲線を示したグラフ。検証済みのSerum Matrixで段階希釈した各アナライトのスタンダードを用いて、アナライト濃度に対するアッセイ応答を決定するために標準曲線を作成。標準曲線は、すべてのアナライトについて、3～4オーダーのアッセイの直線性が確認された。アナライトの濃度はMFIで測定された。

図2.検証済みのSerum Matrixで段階希釈した各アナライトのスタンダードを用いて、アナライト濃度に対するアッセイ応答を決定するために標準曲線を作成。標準曲線は、すべてのアナライトについて、3～4オーダーのアッセイの直線性が確認された。アナライトの濃度はMFIで測定された。

 

交差反応性

パネル内で有意な交差反応性は認められませんでした。このヒトマイオカインパネルに含まれる抗体のうち、Fractalkine、LIF、IL-6を除くほとんどの抗体はサルと交差反応性があります。以下の交差反応性が認められました。

  • Apelinは、マウス、イヌ、ウサギ、ブタと交差反応性を示す
  • BDNFは、マウスおよびウサギと交差反応性を示す
  • EPOは、イヌおよびウサギと交差反応性を示す
  • IL-15は、ウマと交差反応性を示す
  • Myostatinは、イヌ、ブタ、ウマと交差反応性を示す
  • FABP3 は、ラット、ウサギ、ブタ、ウマと交差反応性を示す
  • FSTL1 は、マウス、ウサギ、ブタ、ウマと交差反応性を示す
  • OSMは、イヌおよびブタと交差反応性を示す
  • FGF-21 は、イヌ、ブタ、ウマと交差反応性を示す

なお、今回の研究では、限られた量の健常サンプルしか検査していないため、他の健常サンプルや疾患サンプルでの交差反応性の可能性も排除できません。

添加回収率 （Spike Recovery）

既知量の各アナライト（標準曲線上のポイント3、4、5）を健常ヒト血清／血漿サンプルに添加しました。回収率は以下の式で算出しました。

算出されたアナライトの濃度／期待される濃度×100

すべての添加サンプルの回収率は70%から130%でした。

他のマルチプレックスパネルとの一貫性と正確性

MILLIPLEX®アッセイ間の一貫性と正確性を検証するために、このヒトマイオカインパネルと他の MILLIPLEX®パネルの両方に含まれるアナライトの定量性を比較しました。すべての標準曲線は重なり合った反応を示し、生体サンプルから算出されたアナライト濃度は非常に高い相関を示しました。

例えば、FGF-21とFABP3のサンプル値は、MILLIPLEX® Human Myokine PanelとMILLIPLEX® Human Liver Protein and Human CVD1 Panelの両方を使用して測定されました。標準曲線は精製FGF-21のスタンダードを用いて作成されました。2つのパネルから得られたFABP3は、アッセイ応答とアッセイの直線範囲が重複していることが示されました。アッセイ相関は良好で、傾きとR値は1に近づきました（図3）。

 

マルチプレックスアッセイを比較するためのMFI値を示すグラフ。MILLIPLEX® Human Myokine PanelとMILLIPLEX® Liver PanelおよびMILLIPLEX® CVD Panelの比較。FGF-21（上）およびFABP3（下）。

図3.MILLIPLEX® Human Myokine Panel と MILLIPLEX® Liver Panel および MILLIPLEX®CVD Panelの比較。FGF-21（上）およびFABP3（下）。

FGF-21とFABP3に加えて、このヒトマイオカインパネルと他のMILLIPLEX® パネルの同じアナライトを比較しました。すべての標準曲線は、重複した反応を示し、アナライト濃度は生体サンプルと非常によく相関しました（データ未掲載）。

健常サンプルと敗血症サンプルの比較

最後に、健常者と敗血症患者の血清／血漿サンプルを用いて、アッセイパネルの生物学的検証を行いました。予想通り、15種類の新規マイオカインがアッセイによって同時に定量できました。FABP3、Irisin、FSTL1、OSM、IL-6、FGF-21、Musclinは、敗血症サンプルで有意に上昇しました（表2）。

 

健常サンプルのデータ [pg/mL]

 ApelinFractalkineBDNFEPOSPARCLIFIL-15MyostatinFABP3IrisinFSTL1OSMIL-6FGF-21Musclin
N8910111213141516171819202122
平均値2281019,5481,239425,3431038,6251,9434956,491133134150
Min003500169,720000740000000
Max42026020,4803,460739,890302040,1103,1102,37017,170379570790
検出率（%）888810063100501338100388875886350
 

敗血症サンプルのデータ [pg/mL]

 ApelinFractalkineBDNFEPOSPARCLIFIL-15MyostatinFABP3IrisinFSTL1OSMIL-6FGF-21Musclin
N323334353637383940414243444546
平均値122789,2801,298544,958673,77738,9721,90514,632566432,016174
Min001100204,800000240000000
Max46041020,18012,5201,258,000806031,600249,1409,06074,1703178,67912,40088…0*
検出率（%）696910041100192528100608497817559
 

表2.健常および敗血症の血清／血漿サンプルで発現したバイオマーカーの比較。FABP3、Irisin、FSTL1、OSM、IL-6、FGF-21、Musclinは、敗血症サンプルで発現が増加することが示された。*アッセイ未実施。

まとめ

MILLIPLEX® Human Myokine Panel は、感度、精度、再現性に優れたパネルです。この新しいパネルで得られたサンプル値は、同じアナライトを含む従来のパネルと一貫しています。本パネルは、代謝性疾患、神経筋疾患、特発性筋疾患などの多様な研究領域において、理想的なイムノアッセイです。

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マイオカインアッセイ
申し訳ございませんが、想定外のエラーが発生しました。

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老化アッセイ
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研究目的での使用に限定されます。診断目的には使用できません。

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参考文献

1.
Pedersen BK, Febbraio MA. 2012. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8(8):457-465. https://doi.org/10.1038/nrendo.2012.49
2.
BKP,aLH. 2000. Exercise and the Immune System: Regulation, Integration, and Adaptation. https://doi.org/10.1152/physrev.2000.80.3.1055
3.
Egan B, Zierath J. 2013. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17(2):162-184. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2012.12.012
4.
Jedrychowski MP, Wrann CD, Paulo JA, Gerber KK, Szpyt J, Robinson MM, Nair KS, Gygi SP, Spiegelman BM. 2015. Detection and Quantitation of Circulating Human Irisin by Tandem Mass Spectrometry.Cell Metab. 2015 Aug 12. pii: S1550-4131(15) 00392-7..
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