A sejtvándorlás és invázió vizsgálata a Millicell^® sejttenyésztő betétek használatával

• Migrációs és inváziós tesztek áttekintése
• Mire van szükségem a sejtmigrációs/invaziós tesztek elvégzéséhez?
• A megfelelő pórusméret kiválasztása a sejtvándorlás/inváziós vizsgálatomhoz
• Migrációs és inváziós próbák optimalizálása
• Migrációs és inváziós próbák mintavételi protokollja
• Migrációs és inváziós próbaminták adatai
• Migrációs és inváziós próbával kapcsolatos tippek és trükkök
/a>
• Terméktáblázat
• Referenciák

Migrációs és inváziós tesztek áttekintése

A sejtmigráció a sejtek irányított mozgása kémiai (pl. kemoattraktáns) vagy mechanikai ingerre adott válaszként. Ez a sejtek fontos tulajdonsága, amely kritikus a sejtfejlődés és a normális folyamatok, például a sebgyógyulás szempontjából. Ugyanakkor olyan betegségekben is szerepet játszik, mint a gyulladás vagy a tumorsejtek migrációja és inváziója.¹ A sejtbiológiában régóta használják a migrációs és inváziós vizsgálatokat a tumoros áttétek tanulmányozására, a legelterjedtebb vizsgálatok a Boyden-próbarendszeren alapulnak. Ezt a rendszert először 1962-ben Dr. Boyden használta, ahol bemutatta a Millipore^® porózus membrán használatát a kemotaxishoz.²

Ma a migrációs vizsgálatok Millicell^® lógó sejttenyésztő betétekkel végezhetők, amelyek ezen a Boyden-féle vizsgálati rendszeren alapulnak, míg az inváziós vizsgálatokhoz a membránt ECM-géllel, például Matrigellel^® kell bevonni, majd a sejteket ráültetni. Ez a bevonat akadályként hat a sejtek számára, hogy az invázió során áthatoljanak rajta. Különböző pórusméretű betétek állnak rendelkezésre, a felhasználandó sejtek méretétől függően.

A Boyden-kamrás rendszer egy üreges műanyag kamrát használ, amelynek egyik végét egy porózus membránnal zárják le. Ez a kamra ezután egy nagyobb üreg fölé van függesztve, amely médiumot és/vagy kemoattraktánsokat tartalmazhat. A sejteket szérummentes közegben mossuk, hogy biztosítsuk az összes szérum eltávolítását, mielőtt a membrán apikális (felső) oldalára helyezzük a betétekben. A megfelelő kemoattraktánst tartalmazó médiumot (pl, Szarvasmarha magzati szérumot, különböző citokineket stb.) adunk a betétek alatti lyukakba (valamint egy negatív kontrollt, ahol a médiumban nincs kemoattraktáns), és a sejteket 37 °C-os CO₂ inkubátorban hagyjuk a kívánt ideig.

Az inkubációt követően a nem migrált sejteket óvatosan eltávolítjuk a membrán apikális oldaláról, és a membrán bazolaterális oldalán lévő migrált sejteket sejtfestés és képalkotás segítségével számszerűsíthetjük.

1. ábra. Inváziós vizsgálat elve. A sejteket a membrán apikális oldalán lévő ECM-bevonatú betétekbe ültetjük, miközben a megfelelő kemoattraktánst tartalmazó médiumot adunk a sejttenyésztő lemezhez. A lemezeket a szükséges ideig (pl. 24 órán át) hagyjuk állni, hogy a sejtek a membrán bazolaterális oldalára inváziót indíthassanak. A nem behatolt sejteket vattapamaccsal távolítjuk el, a behatolt sejteket pedig rögzítjük és megfestjük a képalkotás és a számlálás előtt. Migrációs vizsgálatokhoz egyszerűen hagyjuk el az ECM bevonatolás lépését.

Mire van szükségem egy migrációs/invazív vizsgálat lefuttatásához?

• Millicell^® sejttenyésztési betétek (lásd a betétválasztékot alább)
• Extracelluláris mátrix (e.g. Corning^® Matrigel^® Bázismembrán mátrix)
• Szövettenyésztő lemezek
• Cellavonalak
• Szövettenyésztő közegek
• Csírvonzószer (pl.g., Szarvasmarha magzati szérum)
• Fixáló oldat (pl. 70%-os etanol vagy 4%-os paraformaldehid)
• Szteril csipeszek
• Pamut tamponok
• Tartalmazó oldat (pl., Crystal Violet vagy DAPI)
• Szteril víz

A megfelelő pórusméret kiválasztása a sejtvándorlási/inváziós vizsgálathoz

A betét pórusmérete a vizsgálatban használni kívánt sejtek típusától függ. Fontos, hogy a kisebb sejttípusok esetében ne használjunk túl nagy pórusméretet, de a pórusok nem lehetnek olyan kicsik, hogy a migráló sejtek még a kemoattraktáns jelenlétében sem férnek át. Az 1. táblázat a szakirodalom alapján a migráló és invazív sejttípusok kiválasztásához ajánlott membránpórusméreteket mutatja be. 

1. táblázat. Sejttenyésztési betétmembrán pórusméret és kísérőpróbák.

Alkalmazás	Cellatípus	Cellatípus./b>	Pórusméret (µm)	Pórusméret (µm)
Migráció Kémotaxis sejtmigráció Haptotaxis sejtmigráció Boyden-kamrás próba	Endothelialis3-4,8, HUVEC6-7/sup>, HMVEC5-6	3.0, 8.0
	Neutrofilek
	Neutrofilek9-12, PMNs12	3.0
	Lymphocyták9,13, makrofágok14-15, monociták16-17	3.0, 5.0
	Neuronális sejtek18,19	3.0
Dendritikus sejtek17,20-22	3.0, 5.0, 8.0
Epithelialis fibroblasztok23-25	3.0, 8.0
Leukociták12,13,26,27	3.0, 5.0
Simaizom28-30	8.0
b>Invázió Tumorinvázió Vér-agy gát /li> Vérkeringés	< Melanoma31-33	8.0
	Glioma Lymphoma34-36, Jurkat38	8.0
	Osteoblasztok39,41-43	5.0, 8.0
Mellrák37,40	8.0
Endotheliális40,44-49	3.0, 8.0

A Millicell^® függő sejttenyésztő betétek számos, a migrációs és inváziós vizsgálatokkal kompatibilis opcióval rendelkeznek (lásd a 2. táblázatot). Minden betét egyenként buborékcsomagolásban van, és illeszkedik a standard szövettenyésztő lemezekhez.     

2. táblázat. Millicell^® sejtkultúra-betétek migrációs és inváziós vizsgálatokhoz. A PET-membrán szövetkultúra-kezelt, hogy elősegítse a sejtek rögzülését és növekedését.

	Leírás	Membránterület			p>Optikai tulajdonság	Pore Size	Pore Size	Pórussűrűség (pórusok/cm2)	Cat. No. (48/pk)
Millicell® 24 lyukú betétek	0.3 cm2	Translucent	3,0 µm 5,0 µm 8.0 µm	2 × 106 6 × 105 2 × 105	PTSP24H48 PTMP24H48 PTEP24H48
Millicell® 12 lyukú betétek	1.1 cm2	Translucent	3.0 µm 5. 0 µm 8.0 µm	2 × 106 6 × 105 2 × 105	PTSP12H48 PTMP12H48 PTEP12H48
Millicell® 6 lyukú betétek	4.5 cm2	Translucent	3.0 µm 5.0 µm 8.0 µm	2 × 106 6 × 105 2 × 105	PTSP06H48 PTMP06H48 PTEP06H48

Migrációs és inváziós tesztek optimalizálása

1. Kiválasztás beillesztése: Lásd a "Millicell^® sejtkultúra betét kiválasztása migrációs és inváziós vizsgálatokhoz" című részt a fenti szakaszban.
2. Szervezetek beültetési sűrűsége: Fontos, hogy az adott sejtvonalhoz optimalizáljuk a vetési sűrűséget. Túl magas koncentráció esetén a sejteket nehéz lesz megszámolni, vagy túltelíthetik a membrán pórusait. A túl kevés hozzáadott sejt következetlen számláláshoz és eredményekhez vezethet.
3. Chemoattraktáns koncentráció: Az Ön által választott kemoattraktáns optimalizálása fontos lépés, különösen akkor, ha nincsenek korábban publikált adatok az Ön által használt sejtvonal és a kemoattraktáns közötti kölcsönhatásról. Ebben az esetben jó lehet, ha a vizsgálatot a kemoattraktáns több különböző sorozatos hígításával futtatjuk. A különböző sejttípusok válasza a használt kemoattraktáns függvényében változhat. Egy jól tanulmányozott kemoattraktáns, például az FBS esetében a 10%-os szérumkoncentráció jó kiindulási pont, miközben optimalizáljuk a beültetési sűrűséget.
4. Időzítés: Fontos, hogy optimalizálja az inkubációs időt a migrációs vizsgálatokhoz, mivel a legmegfelelőbb inkubációs idő a sejttípustól és a használt kemoattraktánstól függ (általában 16-24 óra a jó kiindulási pont, de egyes sejtvonalaknak hosszabb időre van szükségük).
5. Cellafestés és -számlálás: A migrált sejtek leképezésekor és megszámlálásakor többféle festési módszer is alkalmazható. Ezek közé tartozik a kristályviola (teljes sejtfestés) és a DAPI-festés (a sejtmagok festése). A rögzítés és festés után a sejtek inverz mikroszkóp segítségével vizualizálhatók és számszerűsíthetők.
6. Médiumtérfogat: A Millicell^® lógó sejttenyésztő betétek kompatibilisek a legtöbb szövettenyésztő lemezzel. Mivel a kútméretek márkánként némileg eltérhetnek, a legjobb gyakorlat, ha optimalizáljuk, hogy mennyi médiumra van szükség a kútban, hogy az elérje ugyanazt a szintet, mint maga a betétben lévő médium. A 24 lyukú formátumok esetében a jó kiindulási pontok a következők: 100 µl a betétben 600 µl a kútban, vagy 200 µl a betétben és 900 µl a kútban.

Migrációs és inváziós vizsgálat mintaprotokollja - A beültetési sűrűség optimalizálása

Materialok:

• Magas migrációs/inváziós képességű sejtvonal, pl.:

  Magas migrációs/inváziós sejtvonal, pl.:

  Magas migrációs/inváziós sejtvonal, HT 1080 sejtek

  Magas migrációs képességű sejtvonal, pl. NIH 3T3 sejtek

  alacsony migrációs képességű sejtvonal, Pl, MCF-7 sejtek

  Millicell^® sejttenyésztő betétek, 8 μM PET, 24 lyuk

  Corning^® Costar^® 24 lyukú lemezek

  Greiner 75 cm²-es szövettenyésztő lombikok

  Tripszin-EDTA oldat

  EDTA 0.02%-os oldat D-PBS-ben

  Corning^® Matrigel.sup>® Növekedési faktor csökkentett (GFR) bazális membránmátrix

  Bevonó puffer

  • 0.01M Tris (pH 8,0)
  • 0.7% NaCl

• HT 1080 & MCF-7 apikális táptalaj / kontroll táptalaj (szérum nélkül)
  o   EMEM
  o   50 egység penicillin / 50 µg/mL streptomicin
  o   2 mM L-glutamin
  o   Nem esszenciális aminosavak

• HT 1080 & MCF-7 táptalaj /< alapozó tesztközeg (10% FBS)
  o   EMEM
  o   50 egység Penicillin / 50 µg/mL Streptomycin
  o   2 mM L-glutamin
  o   Nem esszenciális aminosavak
  o   10% FBS

• NIH 3T3
b> kultúramédium (10% borjúszérum)
o   DMEM
o   50 egység penicillin / 50 µg/mL Streptomycin
o   2 mM L-glutamin
o   10% borjúszérum

• NIH 3T3
b> apikális táptalaj/kontroll táptalaj (szérum nélkül)
o   DMEM
o   50 egység penicillin / 50 µg/mL streptomicin
o   2 mM L-glutamin

• NIH 3T3
b> alapközeg (10% FBS)
o   DMEM
o   50 egység penicillin / 50 µg/ml streptomicin
o   2 mM L-glutamin
o    10% FBS

Bevonási protokoll az inváziós vizsgálatokhoz

1. Aliquotálja és tárolja a Matrigelt^® -20°C-on. Az aliquotot jégen vagy 4°C-on olvassa fel.
2. Készítse el a bevonóoldatot a Matrigel hűtött bevonópufferrel történő hígításával 200 µg/ml végső koncentrációra. Óvatosan keverje össze, és további felhasználásig tárolja jégen.
   • Tipp: Hűtse le a pipettahegyeket és/vagy más anyagokat, amelyek e lépés során érintkeznek a Matrigel^®-val.
3. Steril csipesszel helyezze a kívánt számú Millicell^® függőbetétet 24 lyukú szövettenyésztő lemezekbe.
4. Óvatosan pipettázzon 100 ml bevonóoldatot a betétek apikális oldalának közepére, és rázás nélkül inkubálja a zárt lemezt 37°C-on 2-3 órán keresztül. Ha ez megtörtént, ügyeljen arra, hogy a következő lépéseket gyorsan kövesse, hogy elkerülje a gél kiszáradását.

1. nap: Sejtkultúra-betétek beültetése sejtekkel

1. A sejteket leválasztottuk a sejttenyésztő lombikokból, és a tripszin semlegesítésére szérumot tartalmazó táptalajban reszuszpendáltuk. 
2. A sejteket kétszer mostuk szérummentes közegben, hogy biztosítsuk az összes szérum eltávolítását.
3. A sejtszuszpenziót megszámoltuk és sorozatosan hígítottuk a szükséges koncentrációig szérummentes közegben.
4. A sejttenyésztő betéteket steril csipesszel kivettük a csomagolásukból és a tenyésztőlemezek mélyedéseibe helyeztük. Ezt addig ismételtük, amíg a kívánt számú lyuk nem tartalmazta a betéteket. Az inváziós vizsgálatokhoz használjunk ECM-bevonatú sejtkultúra-betéteket a fent leírtak szerint.
5. A sejteket a betét belsejére, a membrán apikális oldalára vetettük (100 µl minden egyes sejtszuszpenzióból). 
6. 600 µl vizsgálati tápfolyadékot adtunk minden egyes betét bazolaterális oldalára a kutakba. Ez a közeg a lemez egyik felében 10% FBS-t tartalmazott kemoattraktánsként a vizsgálati mintákhoz, míg a lemez másik felében szérummentes közeget használtunk kontrollként. Ültetési sűrűségenként három ismétlést használtunk azoknál, amelyekben FBS volt a médiában, illetve azoknál, amelyekben nem volt FBS.  Egy sejtek nélküli betétet üres kontrollként használtunk. A beültetett lemezeket 37°C-on, 5% CO₂-on 24 órán keresztül nedvesített inkubátorba helyeztük.

2. nap: A vándorolt sejtek értékelése

1. A 24 lyukú lemez mélyedéseiből eltávolítottuk a médiát. 
2. Egy médiában megnedvesített vattapamacs segítségével óvatosan eltávolítottuk a megmaradt sejteket, amelyek nem vándoroltak a membrán apikális oldaláról a betétben. Ezt úgy végeztük, hogy a megnedvesített vattapamacsot óvatosan többször körbeforgattuk a betét körül az óramutató járásával megegyező és ellentétes irányban. Nagyon fontos, hogy itt vigyázzunk, nehogy megsérüljön a membrán.
3. A sejteket 4%-os paraformaldehidben fixáltuk 10 percig, majd kétszer PBS-szel mostuk.
4. A sejteket 0,1%-os Triton X-100-ban permeabilizáltuk 10 percig, mielőtt kétszer PBS-szel mostuk volna.
5. A sejteket ezután 1 µM DAPI oldattal festettük 15 percig, majd egyszer mostuk PBS-szel.
6. 900 µl molekuláris minőségű vizet adtunk a 24 lyukú lemez mélyedéseibe, és 200 µl-t a 24 lyukú lemezen belül a betét apikális oldalára.  
7. A betéteket közvetlenül a 24 lyukú lemezből a DAPI-szűrőn 10x objektívvel képeztük le. Fontos, hogy a képbeállítások konzisztensek legyenek a minták között. 
8. A képeket felvettük, és a migrált sejteket minden egyes betétnél négy látómezőben megszámoltuk.
9. A 0,5%-os kristályviolettel történő tartás is megtörtént. A 24 lyukú lemez mélyedéseibe 900 µl PBS-t, a 24 lyukú lemezen belül pedig 200 µl molekuláris minőségű vizet adtunk a betét apikális oldalához a képalkotás előtt.

A minták elmenthetők és szükség esetén újrafesthetők. A betéteket 4 °C-on, molekuláris minőségű vízben lehet tárolni.

2. ábra. Példa 24 lyukú lemez elrendezésére a sejtmigrációs vizsgálatok (vagy invaziós vizsgálatok, ha Matrigel^® bevonatú betéteket használunk) vetési sűrűségének optimalizálására.

Minták migrációs és inváziós vizsgálatok adatai

A migrációs és inváziós vizsgálatokat az előző szakaszban leírtak szerint végeztük. A kristályviola festést ezen 24 órás migrációs próbákat követően végeztük el három sejtvonalon (HT 1080, NIH 3T3 és MCF-7) 10%-os FBS-szel és anélkül. Ez lehetővé tette, hogy a migrált sejteket egyértelműen leképezzük, megmutatva a migráció mértékét az egyes sejtvonalak esetében az egyes feltételek mellett (a képek a 3. ábrán láthatók). A HT 1080 sejtek képesek az invázióra és a migrációra, az NIH 3T3 sejtek csak az ebben a kísérletben vázolt feltételek mellett képesek a migrációra, míg az MCF-7 sejtek képtelenek a pórusokon keresztül a kemoattraktáns felé vándorolni.

3. ábra. A vándorló sejtek (A - HT1080, B - NIH 3T3, C - MCF-7) kristályibolya festése a membrán bazolaterális oldalán 24 óra elteltével, 10% FBS és Matrigel^® (200 µg/ml) mellett és anélkül, különböző vetési sűrűségek mellett. A reprezentatív képek egy látómezőből, egy beültetési ismétlésből készültek minden egyes vetési sűrűségnél. A HT 1080 és NIH 3T3 sejtvonalak képesek a pórusokon keresztül a kemoattraktáns felé vándorolni, míg az MCF-7 sejtek nem. Csak a HT 1080 sejtvonal képes átjutni a Matrigel^® bevonatú membránon.

A kristályviola festés mellett a sejteket DAPI-val is megfestettük, hogy fluoreszcens mikroszkóp segítségével képet készíthessünk és megszámolhassuk őket (lásd a 4. ábrát). A képalkotást 10x objektívvel és DAPI-szűrővel végeztük. A képek elkészítése után a migrált/invazív sejteket minden egyes betétnél négy látómezőben meg lehetett számolni. A DAPI egy nukleáris festék, amely lehetővé teszi a vándorló/invazív sejtek könnyebb megszámlálását, különösen akkor, ha nagyszámú sejt van jelen a nagyobb beültetési sűrűségben.

4. ábra. A vándorló sejtek (A - HT1080, B - NIH 3T3, C - MCF-7) DAPI festése a membrán bazolaterális oldalán 24 óra elteltével, 10% FBS és Matrigel^® (200 µg/ml) mellett és anélkül, különböző vetési sűrűségek mellett. A reprezentatív képek egy látómezőből, egy beültetési ismétlésből készültek minden egyes vetési sűrűségnél. A HT 1080 és NIH 3T3 sejtvonalak képesek a pórusokon keresztül a kemoattraktáns felé vándorolni, míg az MCF-7 sejtek nem. Csak a HT 1080 sejtvonal képes átjutni a Matrigel^® bevonatú membránon.

A kísérlet célja az volt, hogy optimalizáljuk a vetődési sűrűséget a migrációs és inváziós vizsgálatokhoz, 10% FBS-t használva kemoattraktánsként három különböző sejtvonal esetében, 24 órás inkubációt követően. Az egyes betétekben migráló vagy invazív sejtek számát a sejtek számának átlagolásával számoltuk ki négy látómezőben, DAPI festést és képalkotást követően. Az eredmények grafikus ábrázolása az 5. ábrán látható. Ezek az eredmények lehetővé tették számunkra annak meghatározását, hogy az optimális beültetési sűrűség ebben a kísérletben 25 000 sejt volt betétenként mind a migrációs, mind az inváziós vizsgálatokhoz. A sejtek száma jól elkülönült a kemoattraktánst (+FBS) és a negatív kontrollt (-FBS) tartalmazó betétek között, a betétenkénti 25 000 sejtes beültetési sűrűség mutatta a legjobb jel-zaj arányt a két migráló sejtvonal esetében (5:1 és 6:1 a HT 1080 és az NIH 3T3 esetében). A megfelelő kontrollokat minden sejtvonal esetében megvizsgáltuk, hogy összehasonlítsuk az FBS-szel és az FBS nélküli feltételeket (az adatok nem láthatóak). A megfelelő vetési sűrűség a felhasználó által vizsgálandó konkrét körülményektől függ (pl. a migráció ideje, a használt sejtvonal, az alkalmazott kemoattraktáns stb.) 

5. ábra. A membránok bazolaterális oldalán 24 óra elteltével, 10% FBS és Matrigel^® (200 µg/ml) mellett és anélkül, különböző beültetési sűrűségeknél a vándorló sejtek számszerűsítése (a négy látómezőből, három betétismétlésből megszámolt sejtek átlaga). A HT 1080 és NIH 3T3 sejtvonalak képesek a pórusokon keresztül a kemoattraktáns felé vándorolni, míg az MCF-7 sejtek nem. Csak a HT 1080 sejtvonal képes átjutni a Matrigel^® bevonatú membránon.

Tippek és trükkök a migrációs és inváziós vizsgálatokhoz

• Negatív kontrollként fontos, hogy kemoattraktáns nélküli médiában lévő sejtkultúra-betéteket vegyünk fel, valamint hogy azonosítsuk a háttérmigrációt. Ezenkívül nem migráló sejtvonalak (pl. MCF-7) is használhatók kiegészítő kontrollként.
• A sejtszuszpenziók készítésekor ügyeljen a sejtek csomóinak szétbontására (óvatosan, kézzel, kisebb furatú pipettával pipettázzon), hogy elkerülje a sejtek aggregációját a betét közepén vagy szélein. Mindig melegített tápfolyadékot használjon, hogy a sejtek ne aggregálódjanak.
• Gondoskodjon arról, hogy a sejttenyésztő betéteket megfelelően helyezze el a szövettenyésztő lemez mélyedéseiben. Több különböző típusú lemez létezik, amelyek függesztett betétekkel használhatók, ezért fontos, hogy a betétek megfelelően üljenek, hogy lehetővé tegyék az egyenletes vándorlást/inváziót. Győződjön meg róla, hogy a lemez fedele megfelelően záródni tud, hogy megakadályozza a párolgást az inkubáció során (tiszta, kesztyűs kézzel, csipesszel is a helyére mozgathatja a sejttenyésztő betéteket az áthelyezés után, ha azok elmozdulnak a helyükről).
  
• A sejteket mindenképpen szuszpendálja szérummentes médiumban, és néhányszor óvatosan pipettázza őket, mielőtt beülteti őket a kutakba, hogy elkerülje a szennyeződéseket és csökkentse a sejtek csomósodását.
• Elkerülhetetlen a különböző paraméterek, mint például az invázió időtartama, a vetési sűrűség és a Matrigel^® koncentráció optimalizálása a kísérlet és a kiválasztott sejttípus függvényében a jobb pontosság és eredmények érdekében.
• A többszöri fagyasztási/felolvasztási ciklusok elkerülése érdekében kezdetben a Matrigel^® palackban kell tartani. Szükség esetén olvasztja fel az egyes injekciós üvegeket.
• Amennyire csak lehetséges, kerülje a légbuborékokat a Matrigel^® minden egyes betétbe történő pipettázásakor.
• Győződjön meg arról, hogy a Matrigel^® bevonat egyenletesen eloszlik és megszilárdul a sejtek beültetése előtt. Használjon csipeszt a betét kiemeléséhez és vizuálisan ellenőrizze.
• Legyen nagyon óvatos, amikor eltávolítja a nem vándorló/invazív sejteket a membrán apikális oldaláról. A túl nagy nyomás a membrán leválásához vezethet, vagy elmozdíthatja a vándorolt/invazív sejtek egy részét (6. ábra).
• A sejttenyésztési betéteket csipesszel vegye fel, majd a betétet tegye át egy tiszta, kesztyűs kézbe, hogy segítse a fogást a betét lemosásakor. Ügyeljen arra, hogy eközben ne érintse meg magát a tényleges membránt.
• A különböző fixálószerek használhatók, például 70%-os etanol vagy 7%-os paraformaldehid. Ha alkoholt használ a sejtek rögzítéséhez, kristályibolya festéssel kombinálva, ügyeljen arra, hogy néhány napos időablakon belül képet készítsen és megszámolja a sejteket, mivel a sejtstruktúrák elmosódhatnak, és nehezebb lehet megszámolni őket, ha túl sokáig hagyja őket.
• A festés után a Millicell^® betéteket megfelelően kell tárolni, hogy elkerülje a kiszáradást és az elmosódott képeket.

6. ábra. A Millicell^® betétek kristályibolya festése. A. A Millicell^® betét eltávolításakor túl nagy nyomás nehezedett a Millicell^® betétre, ami a membránt behorpasztotta, és a betét a képalkotáskor nem volt egy fókuszsíkban. B. A Millicell^® betétek kristályviola festése etanol mint fixálószer használatával. Ha etanolt használunk fixálószerként, a mintákat a lehető leghamarabb le kell képezni, hogy elkerüljük a sejtmorfológia etanol általi torzulását.

Hivatkozások

1 - 20

1. Horwitz R, Webb D. 2003. Cell migration. Current Biology. 13(19):R756-R759. https://doi.org/10.1016/j.cub.2003.09.014

2. Boyden S. 1962. THE CHEMOTACTIC EFFECT OF MIXTURES OF ANTIBODY AND ANTIGEN ON POLYMORPHONUCLEAR LEUCOCYTES. 115(3):453-466. https://doi.org/10.1084/jem.115.3.453

3. Sawamiphak S, Ritter M, Acker-Palmer A. 2010. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5(10):1659-1665. https://doi.org/10.1038/nprot.2010.130

4. Tamari T, Kawar-Jaraisy R, Doppelt O, Giladi B, Sabbah N, Zigdon-Giladi H. The Paracrine Role of Endothelial Cells in Bone Formation via CXCR4/SDF-1 Pathway. Cells. 9(6):1325. https://doi.org/10.3390/cells9061325

5. Hamdollah Zadeh M, Glass CA, Magnussen A, Hancox JC, Bates DO. 2008. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial CellsIn Vitroare Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15(7):605-614. https://doi.org/10.1080/10739680802220323

6. Hadjichristou C, Papachristou E, Bonovolias I, Bakopoulou A. 2020. Three-dimensional tissue engineering-based Dentin/Pulp tissue analogue as advanced biocompatibility evaluation tool of dental restorative materials. Dental Materials. 36(2):229-248. https://doi.org/10.1016/j.dental.2019.11.013

7. DU H, SHI H, CHEN D, ZHOU Y, CHE G. 2015. Cross-talk between endothelial and tumor cells via basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor signaling promotes lung cancer growth and angiogenesis. 9(3):1089-1094. https://doi.org/10.3892/ol.2015.2881

8. Matsushita T, Kibayashi T, Katayama T, Yamashita Y, Suzuki S, Kawamata J, Honmou O, Minami M, Shimohama S. 2011. Mesenchymal stem cells transmigrate across brain microvascular endothelial cell monolayers through transiently formed inter-endothelial gaps. Neuroscience Letters. 502(1):41-45. https://doi.org/10.1016/j.neulet.2011.07.021

9. Sanders SP, Proud D. Viral Modulation of airway inflammation. Asthma: Causes and Mechanisms, 4; 1999. 23 p.

10. Horbett TA, Klumb, LA. Cell culturing: surface aspects and considerations. New York, NY: Marcel Dekker, Inc.; 1996. 351-445 p:

11. Kidney JC, Proud D. 2000. Neutrophil Transmigration across Human Airway Epithelial Monolayers. Am J Respir Cell Mol Biol. 23(3):389-395. https://doi.org/10.1165/ajrcmb.23.3.4068

12. Van Oostveldt K, Paape M, Burvenich C. 2002. Apoptosis of Bovine Neutrophils Following Diapedesis Through a Monolayer of Endothelial and Mammary Epithelial Cells. Journal of Dairy Science. 85(1):139-147. https://doi.org/10.3168/jds.s0022-0302(02)74062-9

13. Welch HC, Condliffe AM, Milne LJ, Ferguson GJ, Hill K, Webb LM, Okkenhaug K, Coadwell WJ, Andrews SR, Thelen M, et al. 2005. P-Rex1 Regulates Neutrophil Function. Current Biology. 15(20):1867-1873. https://doi.org/10.1016/j.cub.2005.09.050

14. Heise R, Vetter-Kauczok CS, Skazik C, Czaja K, Marquardt Y, Lue H, Merk HF, Bernhagen J, Baron JM. 2012. Expression and Function of Macrophage Migration Inhibitory Factor in the Pathogenesis of UV-Induced Cutaneous Nonmelanoma Skin Cancer?. 88(5):1157-1164. https://doi.org/10.1111/j.1751-1097.2012.01108.x

15. Wang X, Ma G, Zhang R, Liu L, Zhu J, Zhu H. 2019. Molecular characterization and biological functioning of interleukin-8 in Siberian sturgeon (Acipenser baeri). Fish & Shellfish Immunology. 9091-101. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2019.04.010

16. Cappione A, Chen C, Neville SC, Nadler ST. A comprehensive workflow for screening and real-time analysis of cell migration. SigmaAldrich, 2016:

17. Spary LK, Salimu J, Webber JP, Clayton A, Mason MD, Tabi Z. 2014. Tumor stroma-derived factors skew monocyte to dendritic cell differentiation toward a suppressive CD14⁺PD-L1⁺phenotype in prostate cancer. OncoImmunology. 3(9):e955331. https://doi.org/10.4161/21624011.2014.955331

18. Sokolowski JD, Chabanon-Hicks CN, Han CZ, Heffron DS, Mandell JW. Fractalkine is a â??find-meâ? signal released by neurons undergoing ethanol-induced apoptosis. Front. Cell. Neurosci.. 8 https://doi.org/10.3389/fncel.2014.00360

19. Pruyn SA. Stability and Biodistribution of Endocannabinoids Across the Human Brain Microvascular Endothelium Barrier. Albany College of Pharmacy and Health Sciences; 2019:

20. Tucci M, Ciavarella S, Strippoli S, Brunetti O, Dammacco F, Silvestris F. 2011. Immature dendritic cells from patients with multiple myeloma are prone to osteoclast differentiation in vitro. Experimental Hematology. 39(7):773-783.e1. https://doi.org/10.1016/j.exphem.2011.04.006

21 - 40

21. Fell LH, Seiler-Mußler S, Sellier AB, Rotter B, Winter P, Sester M, Fliser D, Heine GH, Zawada AM. 2016. Impact of individual intravenous iron preparations on the differentiation of monocytes towards macrophages and dendritic cells. Nephrol. Dial. Transplant.. 31(11):1835-1845. https://doi.org/10.1093/ndt/gfw045

22. Su Q, Igyártó BZ. 2019. Keratinocytes Share Gene Expression Fingerprint with Epidermal Langerhans Cells via mRNA Transfer. Journal of Investigative Dermatology. 139(11):2313-2323.e8. https://doi.org/10.1016/j.jid.2019.05.006

23. Lee D, Cho K. 2005. The effects of epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts on the formation of cutaneous basement membrane in three-dimensional culture systems. Arch Dermatol Res. 296(7):296-302. https://doi.org/10.1007/s00403-004-0529-5

24. Díaz-Coránguez M, Segovia J, López-Ornelas A, Puerta-Guardo H, Ludert J, Chávez B, Meraz-Cruz N, González-Mariscal L. Transmigration of Neural Stem Cells across the Blood Brain Barrier Induced by Glioma Cells. PLoS ONE. 8(4):e60655. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0060655

25. Huang S, Liu F, Niu Q, Li Y, Liu C, Zhang L, Ni D, Pu X. GLIPR-2 Overexpression in HK-2 Cells Promotes Cell EMT and Migration through ERK1/2 Activation. PLoS ONE. 8(3):e58574. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058574

26. den Broeder AA, Wanten GJ, Oyen WJ, Naber T, van Riel PL, Barrera P. Neutrophil migration and production of reactive oxygen species during treatment with a fully human anti-tumor necrosis factor-alpha monoclonal antibody in patients with rheumatoid arthritis. The Journal of rheumatology. 2003; 30(2)232-237:

27. Nishihara H, Soldati S, Mossu A, Rosito M, Rudolph H, Muller WA, Latorre D, Sallusto F, Sospedra M, Martin R, et al. 2020. Human CD4+ T cell subsets differ in their abilities to cross endothelial and epithelial brain barriers in vitro. Fluids Barriers CNS. 17(1): https://doi.org/10.1186/s12987-019-0165-2

28. Zhang R, Wu Y, Zhao M, Liu C, Zhou L, Shen S, Liao S, Yang K, Li Q, Wan H. 2009. Role of HIF-1? in the regulation ACE and ACE2 expression in hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 297(4):L631-L640. https://doi.org/10.1152/ajplung.90415.2008

29. Ning Y, Sun Q, Dong Y, Xu W, Zhang W, Huang H, Li Q. 2011. Slit2-N inhibits PDGF-induced migration in rat airway smooth muscle cells: WASP and Arp2/3 involved. Toxicology. 283(1):32-40. https://doi.org/10.1016/j.tox.2011.01.026

30. Wang Y, Wang HJ, Liao Y, Tsai P, Chen K, Cheng H, Lin R, Juo SH. 2012. MicroRNA-195 regulates vascular smooth muscle cell phenotype and prevents neointimal formation. 95(4):517-526. https://doi.org/10.1093/cvr/cvs223

31. Zhang W, Tang B, Huang Q, Hua Z. 2013. Galangin inhibits tumor growth and metastasis of B16F10 melanoma. J. Cell. Biochem.. 114(1):152-161. https://doi.org/10.1002/jcb.24312

32. Schittek B, Psenner K, Sauer B, Meier F, Iftner T, Garbe C. 2007. The increased expression of Y box-binding protein 1 in melanoma stimulates proliferation and tumor invasion, antagonizes apoptosis and enhances chemoresistance. Int. J. Cancer. 120(10):2110-2118. https://doi.org/10.1002/ijc.22512

33. Meier F, Busch S, Lasithiotakis K, Kulms D, Garbe C, Maczey E, Herlyn M, Schittek B. 2007. Combined targeting of MAPK and AKT signalling pathways is a promising strategy for melanoma treatment. Br J Dermatol. 156(6):1204-1213. https://doi.org/10.1111/j.1365-2133.2007.07821.x

34. Wang Y, Chang S, Wang C, Huang H, Tzeng S. 2020. The selective lipoprotein-associated phospholipase A2 inhibitor darapladib triggers irreversible actions on glioma cell apoptosis and mitochondrial dysfunction. Toxicology and Applied Pharmacology. 402115133. https://doi.org/10.1016/j.taap.2020.115133

35. Bajetto A, Barbieri F, Dorcaratto A, Barbero S, Daga A, Porcile C, Ravetti JL, Zona G, Spaziante R, Corte G, et al. 2006. Expression of CXC chemokine receptors 1?5 and their ligands in human glioma tissues: Role of CXCR4 and SDF1 in glioma cell proliferation and migration. Neurochemistry International. 49(5):423-432. https://doi.org/10.1016/j.neuint.2006.03.003

36. Luo L, Zhang L, Duan C, Wang B, He N, Abulimiti P, Lin Y. 2017. The inhibition role of miR-22 in hepatocellular carcinoma cell migration and invasion via targeting CD147. Cancer Cell Int. 17(1): https://doi.org/10.1186/s12935-016-0380-8

37. Li J, Zhang S, Chen J, Du T, Wang Y, Wang Z. 2009. Modeled microgravity causes changes in the cytoskeleton and focal adhesions, and decreases in migration in malignant human MCF-7 cells. Protoplasma. 238(1-4):23-33. https://doi.org/10.1007/s00709-009-0068-1

38. Baumann L, Prokoph S, Gabriel C, Freudenberg U, Werner C, Beck-Sickinger AG. 2012. A novel, biased-like SDF-1 derivative acts synergistically with starPEG-based heparin hydrogels and improves eEPC migration in vitro. Journal of Controlled Release. 162(1):68-75. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2012.04.049

39. CADET ER, GAFNI RI, MCCARTHY EF, MCCRAY DR, BACHER JD, BARNES KM, BARON J. 2003. MECHANISMS RESPONSIBLE FOR LONGITUDINAL GROWTH OF THE CORTEX. The Journal of Bone and Joint Surgery-American Volume. 85(9):1739-1748. https://doi.org/10.2106/00004623-200309000-00013

40. Zhao F, Li L, Guan L, Yang H, Wu C, Liu Y. 2014. Roles for GP IIb/IIIa and ?v?3 integrins in MDA-MB-231 cell invasion and shear flow-induced cancer cell mechanotransduction. Cancer Letters. 344(1):62-73. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2013.10.019

41 - 49

41. Jiang R, Zhang C, Liu G, Gu R, Wu H. MicroRNA-101 inhibits proliferation, migration and invasion in osteosarcoma cells by targeting ROCK1. American journal of cancer research, 2017; 7(1)88:

42. Jia D, Niu Y, Li D, Liu Z. 2018. lncRNA C2dat1 Promotes Cell Proliferation, Migration, and Invasion by Targeting miR-34a-5p in Osteosarcoma Cells. oncol res. 26(5):753-764. https://doi.org/10.3727/096504017x15024946480113

43. Zhang J, Yang W, Zhou Y, Xiang Y, Wang L, Hu W, Wang W. Baicalein inhibits osteosarcoma cell proliferation and invasion through the miR?183/Ezrin pathway. Mol Med Report. https://doi.org/10.3892/mmr.2018.9036

44. Liu Y, Zhao F, Gu W, Yang H, Meng Q, Zhang Y, Yang H, Duan Q. 2009. The Roles of Platelet GPIIb/IIIa and ?v?3 Integrins during HeLa Cells Adhesion, Migration, and Invasion to Monolayer Endothelium under Static and Dynamic Shear Flow. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 20091-9. https://doi.org/10.1155/2009/829243

45. Toyoda K, Tanaka K, Nakagawa S, Thuy DHD, Ujifuku K, Kamada K, Hayashi K, Matsuo T, Nagata I, Niwa M. 2013. Initial Contact of Glioblastoma Cells with Existing Normal Brain Endothelial Cells Strengthen the Barrier Function via Fibroblast Growth Factor 2 Secretion: A New In Vitro Blood?Brain Barrier Model. Cell Mol Neurobiol. 33(4):489-501. https://doi.org/10.1007/s10571-013-9913-z

46. Hu M, Wang C, Li W, Lu W, Bai Z, Qin D, Yan Q, Zhu J, Krueger BJ, Renne R, et al. A KSHV microRNA Directly Targets G Protein-Coupled Receptor Kinase 2 to Promote the Migration and Invasion of Endothelial Cells by Inducing CXCR2 and Activating AKT Signaling. PLoS Pathog. 11(9):e1005171. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005171

47. Coureuil M, Lécuyer H, Scott MG, Boularan C, Enslen H, Soyer M, Mikaty G, Bourdoulous S, Nassif X, Marullo S. 2010. Meningococcus Hijacks a ?2-Adrenoceptor/?-Arrestin Pathway to Cross Brain Microvasculature Endothelium. Cell. 143(7):1149-1160. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.11.035

48. Almajed FS, Forsythe SJ. 2016. Cronobacter sakazakii clinical isolates overcome host barriers and evade the immune response. Microbial Pathogenesis. 9055-63. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2015.11.014

49. Tian X, Hu T, Zhang H, He L, Huang X, Liu Q, Yu W, He L, Yang Z, Zhang Z, et al. 2013. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23(9):1075-1090. https://doi.org/10.1038/cr.2013.83