Barrier-képződési és áteresztőképességi vizsgálatok Millicell^® függő sejtkultúra-betétekkel

Történet

• Barrier Assay áttekintés/a>
• Mire van szükségem a Lucifer Yellow Assay elvégzéséhez?
• Millicell^® függő sejtkultúra betét kiválasztása
• TEER kimutatási módszer
• TEER alkalmazási jegyzetek, útmutatók és egyéb források
• Lucifer sárga barrier Assay minta protokoll
• Mintagát-barrier Assay mintaadatok
• Mintagát-barrier Assay mintaadatok
• Barrier Assay tippek és trükkök
• Kapcsolódó termékek
• Referenciák

Barrier Assay Overview

A sejtkultúra barrier assay-ket a barrier szövetek (vese, tüdő, bél stb.) modellezésére használják a gyógyszeradagolás, a gyógyszerfelszívódás, a sebgyógyulás, a bakteriális/vírusos fertőzések, a gyulladás és egyéb vizsgálatok során. Ezek a gátak in vitro képezhetők, amikor a hámsejteket egyetlen sejtszuszpenzióként vetik be, és addig nőnek együtt, amíg egyetlen szövetté nem olvadnak össze. Jellemzően ez a szövet egy hámsejt vastagságú, és hámmonorétegnek nevezik. A standard barrier vizsgálatokban a sejteket porózus membránokra ültetik, és noninvazív módon, transzepithelialis elektromos ellenállás (TEER) mérésekkel figyelik meg. A TEER-mérések validált, jelölésmentes és gyors technikák az epiteliális monoréteg barrier kialakulásának jelzésére a további értékelés és kísérletezés előtt. A gátképződést az ellenállás mérésének növekedésével lehet megfigyelni; a konfluens hámréteg magasabb ellenállási értékeknél plató lesz. A legtöbb gátvizsgálathoz az epiteliális monoréteg a kívánt típusú sejtgát, mivel ez modellezi a tüdő-vér, a vese szűrés vagy a bél felszívódás egysejtű vastagságát, és felhasználható a hámsejtek közötti paracelluláris tér elemzésére.  Miután a sejtes gát integritását megerősítették, ezek a szövetek felhasználhatók olyan kísérletekben, amelyek a gát áteresztőképességét, megszakadását vagy erősségét vizsgálják.

A szoros kötés pórusai a paracelluláris transzport fiziológiai kapuőrei a hámszövetekben. A paracelluláris permeabilitási vizsgálatok a monoréteges gátképződést és a paracelluláris szoros átkötések szorosságát mérik egy adott idő alatt egy epitélsejt monorétegen áthaladó molekula mennyiségének mérésével. Ez a fajta vizsgálat élő sejteket igényel, és általában nem roncsoló jellegű (pl. Lucifer-sárga paracelluláris permeabilitási vizsgálat). A vizualizációra általában immunfestést és szöveti immuncitokémiát (ICC) használnak, megelőzve az elektronmikroszkópia szükségességét. Számos ilyen elemzés a festékként, gyógyszerkonjugátumokként vagy az átvitt célfehérje mennyiségeként követett gáton való áthaladásra összpontosít. Az alternatív elemzések a membrán vizualizálását olyan festékekkel, mint a kristályviola, fluoreszcens antitestfestés és ICC.

1. ábra. Barrier assay elve a Millicell^® függő sejttenyésztő betétek használatával. A) A 0. napon a hámsejteket egysejtű szuszpenzióban a Millicell^® függő sejtkultúra-betét membránjára vetjük. B) Néhány nap múlva (~3 nappal a beültetés után az MDCK sejtek esetében) a sejtek eléggé konfluensek lesznek ahhoz, hogy megkezdjük a TEER méréseket, és az ellenállás értéke alapján értékeljük a hámsejtek monorétegének kialakulását. C) A TEER-méréseket naponta vagy kétnaponta lehet végezni a monoréteges gátképződés nyomon követése érdekében, amíg a sejtek nem érnek el egy állandó ellenállási értéket (~7 nappal a beültetés után az MDCK sejtek esetében). D) Ekkor a tápfolyadékot kicseréljük barriervizsgálati folyadékra (Hank kiegyensúlyozott sóoldata), és a membrán apikális oldalára permeabilitásvizsgálati festéket/molekulát (pl. Lucifer sárga festék) adunk. E) A kismolekulákat 37°C-on inkubáljuk a hámmonolayerrel a protokoll ajánlott hosszáig (pl, 1 óra), majd a membránbetét bazolaterális oldaláról származó folyadékot kiértékeljük a kiválasztott molekula átjutásának mértékét. 

Mire van szükségem a Lucifer-sárga gátvizsgálat elvégzéséhez?

• Millicell^® függő sejttenyésztő betét 0,4 vagy 1 µm pórusmérettel (lásd alább a Millicell^® függő sejttenyésztő betét kiválasztása című részt)

	Pórusméret (µm)			Pórusméret (µm)	Pórus sűrűség (pórus/cm2)		Optikai tisztaság	6 lyukú kat. sz.	12-lyukú kat. sz.	24-lyukú kat. sz. sz.
0.4	100 x 106	Translucent	PTHT06H48	PTHT12H48	PTHT24H48
0.4	4 X 106	Clear	PCHT06H48	PCHT12H48	PCHT24H48
1.0	22 x 106	Translucent	PLRP06H48	PLRP12H48	PLRP24H48
1.0	2 x 106	Clear	PTRP06H48	PTRP12H48	PTRP12H48	PTRP24H48

• Vevőlemez (CLS353046, CLS353043, CLS35303047)
• Lucifer sárga festék
• Hank kiegyensúlyozott sóoldata
• Millicell^® ERS 3.0 Digitális Voltohmméter
• Mikrolemez olvasó
• 96-Well fekete/tiszta aljú mikrolemez 

Millicell^® függő sejttenyésztő betét kiválasztása

A függő betéteken barrierpróbákat végzünk, mivel a porózus membránok a standard polisztirol felületekhez képest lényegesen jobb tulajdonságokkal rendelkeznek az ún. 2.5D sejttenyésztésnek nevezik. Az ezekben a betétekben lévő membránok pórusméretükben különböznek, ami a különböző vizsgálati típusok esetében válik fontossá. Például a migrációs vizsgálatokhoz a kísérletben részt vevő sejttípus alapján a pórusméretek legszélesebb skálája áll rendelkezésre.

1. táblázat. Millicell^® sejttenyésztési betét membrán pórusméret és kísérő vizsgálatok.

	Megvalósítás	Cellatípusok	Pórusméret (µm)
Angiogenezis	Endotél 1-2,14, HMVEC 3-4, HUVEC 4-5	3.0 5, 8.0 2-4,14
Ko-kultúra/b> Differenciálódás Kifejlődés Immun crosstalk /li>	Stem 6,8,10, neuronális, neuronális 9-10, és különböző egyéb 7,11	0.4 6-10, 1.0 11
Migráció Kémotaxis sejtmigráció Haptotaxis sejtmigráció <.li>Boyden-kamrás próba	Endothelialis 1-2,14Endothelialis 1-2,14, HMVEC 3-4, HUVEC 4-5	3.0 5, 8.0 2-4,14
	Neutrofileksup> 12,13,15,16, PMNs 16	3.0 12,13,15,16
	Lymphocyták 12,22 12,22/sup>, makrofágok 17-19, monociták 20,21	3.0 12,22, 5.0 19,20
	Neuronális sejtek 24,25	3.0 25
	Dendritikus sejtek 21,26-28	3.0 28, 5.0 21, 8.0 26-28
Neuritok kinövése 29-32	0.4 29, 1,0 32, 3.0 30-31
Epithelialis fibroblasztok 33-35	3.0 33, 8.0 34-35
Leukociták 16,22, 36, 37	3.0 16,22,36, 5.0 37
Simaizom 38-40	8.0 38-40
Invázió Tumor invázió Vér-agy gát Vérkeringés	Melanoma 41-43	8.0 41-43
	Glioma Lymphomasup> 44-46, Jurkat 48	8.0 44-46,48
	Osteoblasztok 49,51-53	5.0 53, 8.0 51-52
Mellrák 47,50	8.0 47,50
< Endotheliális 50, 54-59	3.0 57-58, 8.0 50, 54-56
Szövettan 3D-állványzat <.li>Tüszőképződés	Humán bőrmodell 60-62, 65	0.4 60-61, 3.0 62
Toxicitási vizsgálatok Sebgyógyulás Farmakológiai szűrés	Fibroblasztok 23, 66,67	3.0 23, 66, 67
Humán tüdő 63-64	0.4 63-64
Transzport- és áteresztőképességi vizsgálatok A gyógyszerfelvétel/felszívódás <.li>Ionszállítás Nano/mikro-részecskék	Caco-2 58, 68-75, 78,80, 82	0.4 68-70, 72-74,78,82, 1.0 71, 3.0 74
MDCK 73,76-81	0.4 73,77-78, 1.0 76,79-81

TEER kimutatási módszer

A Millicell^® ERS 3.0 voltohmméter alacsony áramot és feszültséget használ, hogy lehetővé tegye a sejtkultúrákban a hámmonolayerek összefolyásának roncsolásmentes vizsgálatát. A TEER műszerek alacsony váltakozó áramot termelnek, amely elkerüli az elektródok fémlerakódásait és a szövetekre gyakorolt káros hatásokat, amelyeket egyébként a magasabb egyenáram okozhat. A sejtmonoréteg összefolyását a TEER-olvasókkal detektált szöveti ellenállás növekedése vagy platója alapján lehet meghatározni.

MDCK tenyészközeg

• Dulbecco MEM magas glükózzal
• 10% FBS
• 1% (1x) NEAA
• 1% Penicillin/streptomicin
• 4 mM L-glutamin

A sejtek beültetése 24 lyukú Millicell^® függő sejttenyésztő betétre

1. Kultúra MDCK sejteket, amíg 60-80%-ban összefolyóvá nem válnak.
2. Légtelenítse a tápfolyadékot a tenyésztőlombikból.
3. Adjon hozzá steril PBS-t 3 percig szobahőmérsékleten.
4. Aspiráljuk ki a folyadékot a tenyésztőlombikból.
5. Adjunk tripszint a tenyésztőlombikba, és inkubáljuk 37 °C-os, 5% CO₂-os sejttenyésztő inkubátorban.
6. Állítsa le a tripszinreakciót egyenlő részek teljes sejttenyésztő közeg hozzáadásával a lombikhoz.
7. Vegye fel a folyékony szuszpenziót, és centrifugában 300 x g sebességgel forgassa le 3 percig.
8. Rezuszpendálja a sejteket 1 ml teljes sejttenyésztő táptalajban (lásd a fenti MDCK tenyésztő táptalaj receptjét).
9. Számolja meg a sejteket trypánkék és hemocitométer segítségével. Keverje össze a 90% tripan-kéket 10%-os sejtszuszpenzióval (pl, 180 µL trypan-kék és 20 µL sejtszuszpenzió).
10. Számolja meg az élő sejteket a hemocitométeren, és számolja ki a sejtek milliliterenkénti számát.
11. Adjon 900 µL teljes tápfolyadékot a 24 lyukú membránok bazolaterális oldalára.
12. Rezuszpendálja a sejtszuszpenziót megfelelő térfogatban, hogy 200 µl szuszpenziót adagoljon a kívánt sejtbeültetési sűrűséggel (pl, 1250 sejt/betét, 2500 sejt/betét, 5000 sejt/betét).
13. Tegye a 37 °C-os, 5% szén-dioxidos sejtkultúra inkubátorba, és minden második nap cserélje a táptalajt.
    JEGYZET: A legjobb gyakorlat az, hogy a Millicell^® függesztett sejttenyésztő betéthez és a befogadólemezhez való hozzáadás előtt a teljes sejttenyésztő közeget előmelegítse.

A sejtek ellenállóképességének mérése

1. Hagyja, hogy a lemez elérje a szobahőmérsékletet (15-30 perc).
2. Töltse be a tányértérképet, és rendelje a kutakat a Millicell^® ERS 3.0 digitális feszültségmérőn csoportokhoz (lásd a felhasználói útmutató 11. oldalát).
3. Tesztelje a Millicell^® ERS 3.0 digitális feszültségmérőt a hitelesítési adapter segítségével (lásd a p. 22. részét a felhasználói útmutató).
4. Állítsa a MODE kapcsolót Ohms állásba, és kapcsolja be a Power kapcsolót On.
5. Az elektródát úgy fordítsa be, hogy a rövidebb hegy a Millicell^® függő sejttenyésztő betét apikális oldalán, a hosszabb hegy pedig a külső mélyedésben legyen. A rövidebb hegy nem érintkezhet a membránon növő sejtekkel, a hosszabb hegy pedig éppen csak érintse a külső mélyedés alját. A stabil és reprodukálható eredmények biztosítása érdekében győződjön meg arról, hogy az elektródát a lemez és a betét aljához képest 90°-os szögben stabilan tartja.
   JEGYZET: Ha a minta átvitelének megakadályozása érdekében a mérések között öblítésre van szükség, desztillált víz helyett használjon sejttenyésztő médiumot.
6. Jegyezze fel az ellenállást.
7. Határozza meg a vak ellenállást úgy, hogy egy vak lyukba/sejttenyésztési betétbe adjon médiumot vagy elektrolitoldatot (pl., a sejttenyésztő betétet sejtek és teljes sejttenyésztő közeg nélkül).
8. Mérje meg az ellenállást az üres betéten, és használja ezt az értéket "nulla" vagy "háttér" ellenállási szintként. A valódi szöveti ellenállás meghatározásához vonja le az üres betéten mért ellenállást a szöveten (sejtkultúra betét sejtekkel) mért ellenállásból.
9. Az ellenállás fordítottan arányos a szövet területével. Minél nagyobb a membrán, annál kisebb az ellenállás.
   Egységnyi terület ellenállása (Ω × cm²) = Ellenállás (Ω) × effektív membránfelület (cm²)
   MEGJEGYZÉS: Az ellenállás változhat a minta hőmérséklete, a pH és az elektróda oldatban lévő mélysége alapján.

TEER alkalmazási jegyzetek, útmutatók és egyéb források

• Using Immortalized 16HBE14o- Human Bronchial Epithelial Cell Lines to Model Respiratory Lung Diseases
• Millicell^® sejtkultúra betétek és lemezek
• A TEER jobb módja
• MultiScreen^® Caco-2 Assay System

Lucifer Yellow Barrier Assay Sample Protocol

Lépések

1. A membrán/kút apikális és basolaterális oldaláról vegyen fel tápfolyadékot.
   TIPP: Vigyázzon, hogy ne érintse meg és ne piszkálja a membránt aspirálás közben.
2. Mossa/öblítse le a membránt és a kutat előmelegített Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) oldattal.
   TIPP: A felmelegített HBSS a legkisebb hatással van a sejtmonolayerre; a PBS használata károsabb és a festék nagyobb százalékban történő átjutását okozza.
3. A HBSS-t a membrán/kút apikális és basolaterális oldaláról szívja be.
   TIPP: Vigyázzon, hogy ne érintse vagy piszkálja a membránt aspirálás közben.
4. Adagoljon 900 µl HBSS-t a membrán basolaterális oldalára.
5. Adagoljon 200 µl Lucifer sárga festéket (100 µg/mL) a membrán apikális oldalára.
   TIPP: Legyen nagyon óvatos, nehogy véletlenül Lucifer sárga festéket adjon hozzá, vagy a bazolaterális rekeszbe fröccsenjen/csöpögjön. Ez megzavarja a vizsgálati eredmények pontosságát. Pipettázás közben ne bökdösse a membránt.
6. Tegye 37 °C-os, 5% CO₂-os inkubátorba 1 órára. Növelje az inkubációs időt 2-3 órára az olyan alacsony porozitású membránok esetében, mint a 0,4 µm-es átlátszó Millicell^® betétek (PCHT24H48). 
   TIPP: A legjobb eredmény érdekében tartsa a lemezt laposan, és ne rázza.
7. Azt az időt használja fel arra, hogy standardokat készítsen a vizsgálati lemezhez, amelyek azonosítják a mintaértékeket.
         a.  Készítsen egy 100%-os standardot [Std(100)] a következők egyesítésével:
             200 µL Lucifer sárga festék (100 µg/mL) és 900 µL HBSS kombinálásával.
        b.  Hígítsuk fel a standardokat 1:1 arányban sorozatos hígításban.
              500 µL Std(100) 500 µL HBSS-szel együtt adná a Std(50)
        c.  A legalacsonyabb standardnak (a 100%-os HBSS mellett) 0,39% Lucifer-sárgát kell tartalmaznia (ez kilenc standardot és egy tizedik HBSS-t jelentene
                            ).
        d.  Adjunk 100 µL-t minden standardból egy fluoreszcencia spektroszkópiai lemezbe (három példányban).
8. Vegyük ki a lemezt az inkubátorból, és gyűjtsünk 100 µL folyadékot a membránok basolaterális oldaláról, hogy a fluoreszcencia spektroszkópiai lemezbe helyezzük.
   TIPP: A legjobb eredmények érdekében ezt három példányban végezze el, hogy az eredmények technikai ismétlésként átlagolhatók legyenek.
9. Olvassa le a fluoreszcens spektroszkópiai lemezt egy lemezolvasón, és határozza meg a fluoreszcens abszorbanciát 485 nm gerjesztési és 535 nm emissziós hullámhosszon.
10. A generált standard görbét használja a Lucifer-sárga koncentráció kiszámításához minden egyes mélyedésben. Ezek az értékek ezután felhasználhatók az egyes minták százalékos átmenési arányának meghatározásához.
    RFU = relatív fluoreszcencia units, amelyet a lemezolvasó rendel hozzá.

11. A Lucifer-sárga permeabilitási vizsgálat sikerkritériuma általában kevesebb mint öt százalékos átjutás.

Mintagátló vizsgálat adatai

.

3. ábra. Az ábrázolt membránok nagy sűrűségű (1×10⁸) 0,4 µm pórusméretű PET 24 lyukú membránok. Ezek az eredmények a Millicell^® függő sejttenyésztő betéteket (PTHT24H48) két hasonló márkájú betéttel hasonlítják össze. Az MDCK-sejteket mindhárom gyártónál párhuzamosan, azonos vetési sűrűséggel vetettük be. A három márkájú betétek nem különböznek egymástól szignifikánsan a vetést követő 7. napon, és hasonló kinetikát követnek a monoréteg kialakulásában.

4. ábra. A Lucifer-sárga permeabilitási próbák a sejtmonoréteg és a sejtek közötti szoros kötések kialakulását vizsgálják. Minden ábrázolt membrán nagy sűrűségű (1 x 10⁸ pórusú) 0,4 µm pórusméretű PET-membrán 24 lyuk formátumban. Ezek az eredmények a Millicell^® függő sejttenyésztő betétet (PTHT24H48) két másik márkájú betéttel hasonlítják össze. Ezt a vizsgálatot a 3. ábra szerinti vizsgálat 7. napján végeztük. A gátképzés akkor tekinthető sikeresnek, ha a festék kevesebb, mint 5%-ban jut át a membrán apikális oldaláról a membrán bazolaterális oldalára (az 1. ábra utolsó paneljén ábrázolt átjutás). E betétek között nem volt statisztikai különbség.

5. ábra. A TEER-értékek a kiindulási vetési sűrűségtől függnek, amely a sejtek összefolyásával korrelál a Millicell^® függő sejttenyésztő betéten. A nagyobb sejtbeültetési sűrűségek gyorsabban képeznek sejtmonoréteget. A kísérlettől függően a vizsgálat fókuszától függően előnyösebb lehet a magasabb vagy alacsonyabb vetési sűrűség. A fenti példában az MDCK sejteket ugyanabból az állományból vetettük be, és a jelzett napokon mértük az ellenálló képességet. Minden mérést a Millicell^® ERS 3.0 digitális voltohmméterrel végeztünk, Millicell^® függő sejttenyésztő betétekkel (PTHT24H48). 

Barrier Assay tippek és trükkök

• Válassza ki a sejttípusának és a vizsgálatnak leginkább megfelelő membránt (lásd az 1. táblázatot .nbsp;fent)
• Médiumot cseréljen minden második nap, hogy a sejtek elegendő tápanyaghoz jussanak, és fenntartsák a monoréteg/szoros csomópontok kialakulásához szükséges létfontosságú sejtjelzést.
• Ne hagyja a sejteket hosszabb időre az inkubátoron kívül a vizsgálatok előtt. Ez negatívan befolyásolhatja a Lucifer-sárga permeabilitási vizsgálat, valamint más hasonló vizsgálatok eredményeit.
• Győződjön meg arról, hogy a TEER-szonda elektródái teljesen a közegbe vannak merítve a legstabilabb mérési eredmények érdekében.
• A következetes és összehasonlítható leolvasások érdekében tartsa a TEER-szondát minden egyes kútban/betétben ugyanolyan mélyen.
• A stabil és reprodukálható eredmények biztosítása érdekében győződjön meg arról, hogy az elektróda 90°-os szögben helyezkedik el a lemezbetéthez képest.
• A hőmérséklet függvényében változhat az ellenállás. A TEER-mérések alacsonyabb hőmérsékleten (alacsonyabb °C) növekednek (magasabb Ωm Ω). A leolvasás előtt mindenképpen várjon, amíg a minták szobahőmérsékletre akklimatizálódnak.
• Az ellenállást befolyásolja a közeg pH-ja. Az inkubátorból azonnal kihúzott mintákban magasabb szén-dioxid-tartalom lesz jelen, ami alacsonyabb ellenállási értékekkel jár. A szén-dioxid mennyisége a szobahőmérséklethez való akklimatizálódás során kiegyenlítődik a légköri szén-dioxiddal.
• Tisztítsa a TEER elektródákat rendszeresen enzimatikus tisztítószerrel, például Tergazyme^®-val, hogy eltávolítsa a sejttenyésztési közegből az elektródra rakódott fehérjéket. Ez a tisztítási eljárás megtalálható a Millicell^® ERS 3.0 felhasználói kézikönyv.
• A Millicell^® ERS 3.0 modell kábele érzékenyebb a rádióhullámok okozta interferenciára. Ezek mobiltelefonokból, laptopokból, számítógépekből, sugárzó berendezésekből (MRI, röntgen stb.), sőt még okosórákból is származnak. Fontolja meg a vizsgálati terület áthelyezését olyan területre, ahol a legkevesebb ilyen zavaró tényező van.
• Soha ne tegye a Millicell^® ERS 3.0 voltohmmérőt vagy annak elektródaszondáját UV-fény alá. Ez károsítja az elektródaérzékelőt, és pontatlan, változó, vagy a mérés elmaradásához vezet.
• Ha a minta átvitelének megakadályozása érdekében a mérések között öblítésre van szükség, desztillált víz helyett használjon sejttenyésztő közeget.
• Vigyázzon, hogy a membránt ne érintse vagy piszkálja a szívás közben.
• A Lucifer-sárga permeabilitási vizsgálat során az előmelegített HBSS van a legkisebb hatással a sejtmonorétegre; a PBS használata károsabb, és nagyobb százalékban okoz festékátáramlást.
• Nagyon óvatosnak kell lennie, nehogy véletlenül Lucifer-sárga festéket adjon hozzá, vagy a bazolaterális rekeszbe kiömöljön/csöpögjön. Ez megzavarja a vizsgálati eredmények pontosságát. Ne piszkálja a membránt pipettázás közben.
• Mihelyt a Lucifer sárga festéket a membránhoz adta, a legjobb eredmények érdekében tartsa a lemezt laposan, és ne rázza.
• A Lucifer sárga permeabilitási vizsgálat végén a keverés után gyűjtse össze a basolaterális folyadékot (pipettázza fel és le), majd a legjobb eredmény érdekében futtassa le az átjutási eredményeket technikai háromszorosokban.

Hivatkozások

1 - 20

1. Sawamiphak S, Ritter M, Acker-Palmer A. 2010. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5(10):1659-1665. https://doi.org/10.1038/nprot.2010.130

2. Tamari T, Kawar-Jaraisy R, Doppelt O, Giladi B, Sabbah N, Zigdon-Giladi H. The Paracrine Role of Endothelial Cells in Bone Formation via CXCR4/SDF-1 Pathway. Cells. 9(6):1325. https://doi.org/10.3390/cells9061325

3. Hamdollah Zadeh M, Glass CA, Magnussen A, Hancox JC, Bates DO. 2008. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial CellsIn Vitroare Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15(7):605-614. https://doi.org/10.1080/10739680802220323

4. Hadjichristou C, Papachristou E, Bonovolias I, Bakopoulou A. 2020. Three-dimensional tissue engineering-based Dentin/Pulp tissue analogue as advanced biocompatibility evaluation tool of dental restorative materials. Dental Materials. 36(2):229-248. https://doi.org/10.1016/j.dental.2019.11.013

5. DU H, SHI H, CHEN D, ZHOU Y, CHE G. 2015. Cross-talk between endothelial and tumor cells via basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor signaling promotes lung cancer growth and angiogenesis. 9(3):1089-1094. https://doi.org/10.3892/ol.2015.2881

6. Del Tatto M, Ng T, Aliotta JM, Colvin GA, Dooner MS, Berz D, Dooner GJ, Papa EF, Hixson DC, Ramratnam B, et al. 2011. Marrow cell genetic phenotype change induced by human lung cancer cells. Experimental Hematology. 39(11):1072-1080. https://doi.org/10.1016/j.exphem.2011.08.008

7. Hoeks C, Vanheusden M, Peeters LM, Stinissen P, Broux B, Hellings N. Treg-Resistant Cytotoxic CD4+ T Cells Dictate T Helper Cells in Their Vicinity: TH17 Skewing and Modulation of Proliferation. IJMS. 22(11):5660. https://doi.org/10.3390/ijms22115660

8. Sygnecka K, Heider A, Scherf N, Alt R, Franke H, Heine C. 2015. Mesenchymal Stem Cells Support Neuronal Fiber Growth in an Organotypic Brain Slice Co-Culture Model. Stem Cells and Development. 24(7):824-835. https://doi.org/10.1089/scd.2014.0262

9. Maeda T, Ibi M, Shimazu S, Akaike A. 1998. Co-culture With the Striatum Attenuates N-Methyl-D-aspartate Cytotoxicity in Dopaminergic Neurons of Rat Mesencephalic Slice Cultures. Japanese Journal of Pharmacology. 77(2):161-168. https://doi.org/10.1254/jjp.77.161

10. Whitman MC, Bell JL, Nguyen EH, Engle EC. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. JoVE.(149): https://doi.org/10.3791/59911

11. Robinson J, Turkington S, Abey S, Kenea N, Henderson W. 2019. Differential gene expression and gene-set enrichment analysis in Caco-2 monolayers during a 30-day timeline with Dexamethasone exposure. Tissue Barriers. 7(3):e1651597. https://doi.org/10.1080/21688370.2019.1651597

12. Ricciardolo FL, Folkerts G, Folino A, Mognetti B. 2018. Bradykinin in asthma: Modulation of airway inflammation and remodelling. European Journal of Pharmacology. 827181-188. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2018.03.017

13. Vis MAM, Ito K, Hofmann S. Impact of Culture Medium on Cellular Interactions in in vitro Co-culture Systems. Front. Bioeng. Biotechnol.. 8 https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.00911

14. Matsushita T, Kibayashi T, Katayama T, Yamashita Y, Suzuki S, Kawamata J, Honmou O, Minami M, Shimohama S. 2011. Mesenchymal stem cells transmigrate across brain microvascular endothelial cell monolayers through transiently formed inter-endothelial gaps. Neuroscience Letters. 502(1):41-45. https://doi.org/10.1016/j.neulet.2011.07.021

15. Kidney JC, Proud D. 2000. Neutrophil Transmigration across Human Airway Epithelial Monolayers. Am J Respir Cell Mol Biol. 23(3):389-395. https://doi.org/10.1165/ajrcmb.23.3.4068

16. Van Oostveldt K, Paape M, Burvenich C. 2002. Apoptosis of Bovine Neutrophils Following Diapedesis Through a Monolayer of Endothelial and Mammary Epithelial Cells. Journal of Dairy Science. 85(1):139-147. https://doi.org/10.3168/jds.s0022-0302(02)74062-9

17. Heise R, Vetter-Kauczok CS, Skazik C, Czaja K, Marquardt Y, Lue H, Merk HF, Bernhagen J, Baron JM. 2012. Expression and Function of Macrophage Migration Inhibitory Factor in the Pathogenesis of UV-Induced Cutaneous Nonmelanoma Skin Cancer?. 88(5):1157-1164. https://doi.org/10.1111/j.1751-1097.2012.01108.x

18. Yu J, Kim HM, Kim KP, Son Y, Kim M, Park K. 2019. Ceramide kinase regulates the migration of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508(2):361-367. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.11.154

19. Wang X, Ma G, Zhang R, Liu L, Zhu J, Zhu H. 2019. Molecular characterization and biological functioning of interleukin-8 in Siberian sturgeon (Acipenser baeri). Fish & Shellfish Immunology. 9091-101. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2019.04.010

20. Trost B, Walker S, Wang Z, Thiruvahindrapuram B, MacDonald JR, Sung WW, Pereira SL, Whitney J, Chan AJ, Pellecchia G, et al. 2018. A Comprehensive Workflow for Read Depth-Based Identification of Copy-Number Variation from Whole-Genome Sequence Data. The American Journal of Human Genetics. 102(1):142-155. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2017.12.007

21 - 40

21. Spary LK, Salimu J, Webber JP, Clayton A, Mason MD, Tabi Z. 2014. Tumor stroma-derived factors skew monocyte to dendritic cell differentiation toward a suppressive CD14⁺PD-L1⁺phenotype in prostate cancer. OncoImmunology. 3(9):e955331. https://doi.org/10.4161/21624011.2014.955331

22. Welch HC, Condliffe AM, Milne LJ, Ferguson GJ, Hill K, Webb LM, Okkenhaug K, Coadwell WJ, Andrews SR, Thelen M, et al. 2005. P-Rex1 Regulates Neutrophil Function. Current Biology. 15(20):1867-1873. https://doi.org/10.1016/j.cub.2005.09.050

23. Zhang Y, Wang B, Meng X, Sun G, Gao C. 2011. Influences of Acid-Treated Multiwalled Carbon Nanotubes on Fibroblasts: Proliferation, Adhesion, Migration, and Wound Healing. Ann Biomed Eng. 39(1):414-426. https://doi.org/10.1007/s10439-010-0151-y

24. Sokolowski JD, Chabanon-Hicks CN, Han CZ, Heffron DS, Mandell JW. Fractalkine is a â??find-meâ? signal released by neurons undergoing ethanol-induced apoptosis. Front. Cell. Neurosci.. 8 https://doi.org/10.3389/fncel.2014.00360

25. Hagan K, Varelas P, Zheng H. 2022. Endocannabinoid System of the Blood?Brain Barrier: Current Understandings and Therapeutic Potentials. Cannabis and Cannabinoid Research. 7(5):561-568. https://doi.org/10.1089/can.2021.0101

26. Tucci M, Ciavarella S, Strippoli S, Brunetti O, Dammacco F, Silvestris F. 2011. Immature dendritic cells from patients with multiple myeloma are prone to osteoclast differentiation in vitro. Experimental Hematology. 39(7):773-783.e1. https://doi.org/10.1016/j.exphem.2011.04.006

27. Fell LH, Seiler-Mußler S, Sellier AB, Rotter B, Winter P, Sester M, Fliser D, Heine GH, Zawada AM. 2016. Impact of individual intravenous iron preparations on the differentiation of monocytes towards macrophages and dendritic cells. Nephrol. Dial. Transplant.. 31(11):1835-1845. https://doi.org/10.1093/ndt/gfw045

28. Su Q, Igyártó BZ. 2019. Keratinocytes Share Gene Expression Fingerprint with Epidermal Langerhans Cells via mRNA Transfer. Journal of Investigative Dermatology. 139(11):2313-2323.e8. https://doi.org/10.1016/j.jid.2019.05.006

29. Hertz J, Qu B, Hu Y, Patel RD, Valenzuela DA, Goldberg JL. 2014. Survival and Integration of Developing and Progenitor-Derived Retinal Ganglion Cells following Transplantation. Cell Transplant. 23(7):855-872. https://doi.org/10.3727/096368913x667024

30. Shetty AK, Turner DA. 1999. Neurite Outgrowth from Progeny of Epidermal Growth Factor–Responsive Hippocampal Stem Cells is Significantly Less Robust than From Fetal Hippocampal Cells Following Grafting Onto Organotypic Hippocampal Slice Cultures: Effect of Brain-Derived Neurotrophic Factor. Journal of Neurobiology. https://doi.org/10.1002/(sici)1097-4695(19990215)38:3<391::aid-neu8>3.0.co;2-4

31. Ichikawa-Tomikawa N, Ogawa J, Douet V, Xu Z, Kamikubo Y, Sakurai T, Kohsaka S, Chiba H, Hattori N, Yamada Y, et al. 2012. Laminin ?1 is essential for mouse cerebellar development. Matrix Biology. 31(1):17-28. https://doi.org/10.1016/j.matbio.2011.09.002

32. Namsolleck P, Boato F, Schwengel K, Paulis L, Matho KS, Geurts N, Thöne-Reineke C, Lucht K, Seidel K, Hallberg A, et al. 2013. AT2-receptor stimulation enhances axonal plasticity after spinal cord injury by upregulating BDNF expression. Neurobiology of Disease. 51177-191. https://doi.org/10.1016/j.nbd.2012.11.008

33. Lee D, Cho K. 2005. The effects of epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts on the formation of cutaneous basement membrane in three-dimensional culture systems. Arch Dermatol Res. 296(7):296-302. https://doi.org/10.1007/s00403-004-0529-5

34. Díaz-Coránguez M, Segovia J, López-Ornelas A, Puerta-Guardo H, Ludert J, Chávez B, Meraz-Cruz N, González-Mariscal L. Transmigration of Neural Stem Cells across the Blood Brain Barrier Induced by Glioma Cells. PLoS ONE. 8(4):e60655. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0060655

35. Huang S, Liu F, Niu Q, Li Y, Liu C, Zhang L, Ni D, Pu X. GLIPR-2 Overexpression in HK-2 Cells Promotes Cell EMT and Migration through ERK1/2 Activation. PLoS ONE. 8(3):e58574. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058574

36. den Broeder A, Wanten G, Oyen W, Naber T, van Riel P, Barrera P. 2003. Neutrophil Migration and Production of Reactive Oxygen Species During Treatment with a Fully Human Anti-Tumor Necrosis Factor-Alpha Monoclonal Antibody in Patients with Rheumatoid Arthritis.  The Journal of Rheumatology. 30(2):232-237.

37. Nishihara H, Soldati S, Mossu A, Rosito M, Rudolph H, Muller WA, Latorre D, Sallusto F, Sospedra M, Martin R, et al. 2020. Human CD4+ T cell subsets differ in their abilities to cross endothelial and epithelial brain barriers in vitro. Fluids Barriers CNS. 17(1): https://doi.org/10.1186/s12987-019-0165-2

38. Zhang R, Wu Y, Zhao M, Liu C, Zhou L, Shen S, Liao S, Yang K, Li Q, Wan H. 2009. Role of HIF-1? in the regulation ACE and ACE2 expression in hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 297(4):L631-L640. https://doi.org/10.1152/ajplung.90415.2008

39. Ning Y, Sun Q, Dong Y, Xu W, Zhang W, Huang H, Li Q. 2011. Slit2-N inhibits PDGF-induced migration in rat airway smooth muscle cells: WASP and Arp2/3 involved. Toxicology. 283(1):32-40. https://doi.org/10.1016/j.tox.2011.01.026

40. Wang Y, Wang HJ, Liao Y, Tsai P, Chen K, Cheng H, Lin R, Juo SH. 2012. MicroRNA-195 regulates vascular smooth muscle cell phenotype and prevents neointimal formation. 95(4):517-526. https://doi.org/10.1093/cvr/cvs223

41 - 60

41. Zhang W, Tang B, Huang Q, Hua Z. 2013. Galangin inhibits tumor growth and metastasis of B16F10 melanoma. J. Cell. Biochem.. 114(1):152-161. https://doi.org/10.1002/jcb.24312

42. Schittek B, Psenner K, Sauer B, Meier F, Iftner T, Garbe C. 2007. The increased expression of Y box-binding protein 1 in melanoma stimulates proliferation and tumor invasion, antagonizes apoptosis and enhances chemoresistance. Int. J. Cancer. 120(10):2110-2118. https://doi.org/10.1002/ijc.22512

43. Meier F, Busch S, Lasithiotakis K, Kulms D, Garbe C, Maczey E, Herlyn M, Schittek B. 2007. Combined targeting of MAPK and AKT signalling pathways is a promising strategy for melanoma treatment. Br J Dermatol. 156(6):1204-1213. https://doi.org/10.1111/j.1365-2133.2007.07821.x

44. Wang Y, Chang S, Wang C, Huang H, Tzeng S. 2020. The selective lipoprotein-associated phospholipase A2 inhibitor darapladib triggers irreversible actions on glioma cell apoptosis and mitochondrial dysfunction. Toxicology and Applied Pharmacology. 402115133. https://doi.org/10.1016/j.taap.2020.115133

45. Bajetto A, Barbieri F, Dorcaratto A, Barbero S, Daga A, Porcile C, Ravetti JL, Zona G, Spaziante R, Corte G, et al. 2006. Expression of CXC chemokine receptors 1?5 and their ligands in human glioma tissues: Role of CXCR4 and SDF1 in glioma cell proliferation and migration. Neurochemistry International. 49(5):423-432. https://doi.org/10.1016/j.neuint.2006.03.003

46. Luo L, Zhang L, Duan C, Wang B, He N, Abulimiti P, Lin Y. 2017. The inhibition role of miR-22 in hepatocellular carcinoma cell migration and invasion via targeting CD147. Cancer Cell Int. 17(1): https://doi.org/10.1186/s12935-016-0380-8

47. Li J, Zhang S, Chen J, Du T, Wang Y, Wang Z. 2009. Modeled microgravity causes changes in the cytoskeleton and focal adhesions, and decreases in migration in malignant human MCF-7 cells. Protoplasma. 238(1-4):23-33. https://doi.org/10.1007/s00709-009-0068-1

48. Baumann L, Prokoph S, Gabriel C, Freudenberg U, Werner C, Beck-Sickinger AG. 2012. A novel, biased-like SDF-1 derivative acts synergistically with starPEG-based heparin hydrogels and improves eEPC migration in vitro. Journal of Controlled Release. 162(1):68-75. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2012.04.049

49. CADET ER, GAFNI RI, MCCARTHY EF, MCCRAY DR, BACHER JD, BARNES KM, BARON J. 2003. MECHANISMS RESPONSIBLE FOR LONGITUDINAL GROWTH OF THE CORTEX. The Journal of Bone and Joint Surgery-American Volume. 85(9):1739-1748. https://doi.org/10.2106/00004623-200309000-00013

50. Zhao F, Li L, Guan L, Yang H, Wu C, Liu Y. 2014. Roles for GP IIb/IIIa and ?v?3 integrins in MDA-MB-231 cell invasion and shear flow-induced cancer cell mechanotransduction. Cancer Letters. 344(1):62-73. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2013.10.019

51. Jiang R, Zhang C, Liu G, Gu R, Wu H. 2017. Inhibits Proliferation, Migration and Invasion in Osteosarcoma Cells by Targeting ROCK1. American Journal of Cancer Research. 7(1):88.

52. Jia D, Niu Y, Li D, Liu Z. 2018. lncRNA C2dat1 Promotes Cell Proliferation, Migration, and Invasion by Targeting miR-34a-5p in Osteosarcoma Cells. oncol res. 26(5):753-764. https://doi.org/10.3727/096504017x15024946480113

53. Zhang J, Yang W, Zhou Y, Xiang Y, Wang L, Hu W, Wang W. Baicalein inhibits osteosarcoma cell proliferation and invasion through the miR?183/Ezrin pathway. Mol Med Report. https://doi.org/10.3892/mmr.2018.9036

54. Liu Y, Zhao F, Gu W, Yang H, Meng Q, Zhang Y, Yang H, Duan Q. 2009. The Roles of Platelet GPIIb/IIIa and ?v?3 Integrins during HeLa Cells Adhesion, Migration, and Invasion to Monolayer Endothelium under Static and Dynamic Shear Flow. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 20091-9. https://doi.org/10.1155/2009/829243

55. Toyoda K, Tanaka K, Nakagawa S, Thuy DHD, Ujifuku K, Kamada K, Hayashi K, Matsuo T, Nagata I, Niwa M. 2013. Initial Contact of Glioblastoma Cells with Existing Normal Brain Endothelial Cells Strengthen the Barrier Function via Fibroblast Growth Factor 2 Secretion: A New In Vitro Blood?Brain Barrier Model. Cell Mol Neurobiol. 33(4):489-501. https://doi.org/10.1007/s10571-013-9913-z

56. Hu M, Wang C, Li W, Lu W, Bai Z, Qin D, Yan Q, Zhu J, Krueger BJ, Renne R, et al. A KSHV microRNA Directly Targets G Protein-Coupled Receptor Kinase 2 to Promote the Migration and Invasion of Endothelial Cells by Inducing CXCR2 and Activating AKT Signaling. PLoS Pathog. 11(9):e1005171. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005171

57. Coureuil M, Lécuyer H, Scott MG, Boularan C, Enslen H, Soyer M, Mikaty G, Bourdoulous S, Nassif X, Marullo S. 2010. Meningococcus Hijacks a ?2-Adrenoceptor/?-Arrestin Pathway to Cross Brain Microvasculature Endothelium. Cell. 143(7):1149-1160. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.11.035

58. Almajed FS, Forsythe SJ. 2016. Cronobacter sakazakii clinical isolates overcome host barriers and evade the immune response. Microbial Pathogenesis. 9055-63. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2015.11.014

59. Tian X, Hu T, Zhang H, He L, Huang X, Liu Q, Yu W, He L, Yang Z, Zhang Z, et al. 2013. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23(9):1075-1090. https://doi.org/10.1038/cr.2013.83

60. Monteiro IP, Shukla A, Marques AP, Reis RL, Hammond PT. 2015. Spray-assisted layer-by-layer assembly on hyaluronic acid scaffolds for skin tissue engineering. J. Biomed. Mater. Res.. 103(1):330-340. https://doi.org/10.1002/jbm.a.35178

61 - 80

61. Vahav I, Broek LJ, Thon M, Monsuur HN, Spiekstra SW, Atac B, Scheper RJ, Lauster R, Lindner G, Marx U, et al. 2020. Reconstructed human skin shows epidermal invagination towards integrated neopapillae indicating early hair follicle formation in vitro. J Tissue Eng Regen Med. 14(6):761-773. https://doi.org/10.1002/term.3039

62. Gottipati A, Elder SH. 2016. Composite Chitosan-Calcium Phosphate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering.83-97. https://doi.org/10.1007/978-81-322-2511-9_4

63. Horváth L, Umehara Y, Jud C, Blank F, Petri-Fink A, Rothen-Rutishauser B. Engineering an in vitro air-blood barrier by 3D bioprinting. Sci Rep. 5(1): https://doi.org/10.1038/srep07974

64. Karp PH, Moninger TO, Weber SP, Nesselhauf TS, Launspach JL, Zabner J, Welsh MJ. An In Vitro Model of Differentiated Human Airway Epithelia: Methods for Establishing Primary Cultures.115-137. https://doi.org/10.1385/1-59259-185-x:115

65. Mohamed Ameer J, Venkatesan RB, Damodaran V, K.V. N, Arumugam S, Pallickaveedu Rajan Asari AK, Kasoju N. 2020. Fabrication of co-cultured tissue constructs using a dual cell seeding compatible cell culture insert with a clip-on scaffold for potential regenerative medicine and toxicological screening applications. Journal of Science: Advanced Materials and Devices. 5(2):207-217. https://doi.org/10.1016/j.jsamd.2020.04.004

66. Velazquez OC, Snyder R, Liu Z, Fairman RM, Herlyn M. 2002. Fibroblast?dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary?like, three?dimensional networks. FASEB j.. 16(10):1316-1318. https://doi.org/10.1096/fj.01-1011fje

67. Schacht K, Jüngst T, Schweinlin M, Ewald A, Groll J, Scheibel T. 2015. Biofabrication of Cell-Loaded 3D Spider Silk Constructs. Angew. Chem. Int. Ed.. 54(9):2816-2820. https://doi.org/10.1002/anie.201409846

68. Tan H, Trier S, Rahbek UL, Dufva M, Kutter JP, Andresen TL. A multi-chamber microfluidic intestinal barrier model using Caco-2 cells for drug transport studies. PLoS ONE. 13(5):e0197101. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0197101

69. Artursson P. 1990. Epithelial Transport Of Drugs In Cell Culture. I: A Model For Studying The Passive Diffusion Of Drugs Over Intestinal Absorbtive (Caco-2) Cells. Journal of Pharmaceutical Sciences. 79(6):476-482. https://doi.org/10.1002/jps.2600790604

70. Artursson P, Palm K, Luthman K. 2001. Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport1PII of original article: S0169-409X(96)00415-2. The article was originally published in Advanced Drug Delivery Reviews 22 (1996) 67?84.1. Advanced Drug Delivery Reviews. 46(1-3):27-43. https://doi.org/10.1016/s0169-409x(00)00128-9

71. Bailey CA, Bryla P, Malick A. 1996. The use of the intestinal epithelial cell culture model, Caco-2, in pharmaceutical development. Advanced Drug Delivery Reviews. 22(1-2):85-103. https://doi.org/10.1016/s0169-409x(96)00416-4

72. Kuhfeld MT, Stratford RE. 1996. In vitro measurement of drug transport using a new diffusion chamber compatible with Millicell® culture supports: Performance with caco-2 monolayers. International Journal of Pharmaceutics. 133(1-2):47-58. https://doi.org/10.1016/0378-5173(95)04415-9

73. van Zeijl MJ, Matlin KS. 1990. Microtubule perturbation inhibits intracellular transport of an apical membrane glycoprotein in a substrate-dependent manner in polarized Madin-Darby canine kidney epithelial cells.. Cell Regul. 1(12):921-936. https://doi.org/10.1091/mbc.1.12.921

74. HIROTANI Y, IKEDA K, KATO R, MYOTOKU M, UMEDA T, IJIRI Y, TANAKA K. 2008. Protective Effects of Lactoferrin against Intestinal Mucosal Damage Induced by Lipopolysaccharide in Human Intestinal Caco-2 Cells. YAKUGAKU ZASSHI. 128(9):1363-1368. https://doi.org/10.1248/yakushi.128.1363

75. Trotta V, Pavan B, Ferraro L, Beggiato S, Traini D, Des Reis LG, Scalia S, Dalpiaz A. 2018. Brain targeting of resveratrol by nasal administration of chitosan-coated lipid microparticles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127250-259. https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2018.02.010

76. Baghirov H, Karaman D, Viitala T, Duchanoy A, Lou Y, Mamaeva V, Pryazhnikov E, Khiroug L, de Lange Davies C, Sahlgren C, et al. Feasibility Study of the Permeability and Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles across the Blood-Brain Barrier. PLoS ONE. 11(8):e0160705. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0160705

77. Milatz S, Piontek J, Hempel C, Meoli L, Grohe C, Fromm A, Lee IM, El-Athman R, Günzel D. 2017. Tight junction strand formation by claudin-10 isoforms and claudin-10a/-10b chimeras. Ann. N.Y. Acad. Sci.. 1405(1):102-115. https://doi.org/10.1111/nyas.13393

78. Hoy B, Löwer M, Weydig C, Carra G, Tegtmeyer N, Geppert T, Schröder P, Sewald N, Backert S, Schneider G, et al. 2010. Helicobacter pyloriHtrA is a new secreted virulence factor that cleaves E?cadherin to disrupt intercellular adhesion. EMBO Rep. 11(10):798-804. https://doi.org/10.1038/embor.2010.114

79. Chen Z, Ma T, Huang C, Zhang L, Zhong J, Han J, Hu T, Li J. 2014. Efficiency of transcellular transport and efflux of flavonoids with different glycosidic units from flavonoids of Litsea coreana L. in a MDCK epithelial cell monolayer model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 5369-76. https://doi.org/10.1016/j.ejps.2013.12.010

80. Volpe DA. 2008. Variability in Caco-2 and MDCK Cell-Based Intestinal Permeability Assays. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97(2):712-725. https://doi.org/10.1002/jps.21010

81 - 82

81. Chen R, Shen C, Xu Q, Liu Y, Li B, Huang C, Ma T, Meng X, Wu M, Li J. 2021. The permeability characteristics and interaction of main components from Si-Ni-San in a MDCK epithelial cell monolayer model. Xenobiotica. 51(2):239-248. https://doi.org/10.1080/00498254.2017.1359433

82. Wang X, Valenzano MC, Mercado JM, Zurbach EP, Mullin JM. 2013. Zinc Supplementation Modifies Tight Junctions and Alters Barrier Function of CACO-2 Human Intestinal Epithelial Layers. Dig Dis Sci. 58(1):77-87. https://doi.org/10.1007/s10620-012-2328-8