Víruskoncentráció ultraszűréssel

• Vírusok izolálása, szaporítása és jellemzése
• Vírusok szaporításának általános módszerei
• Vírusok szaporításának általános módszerei
• Víruskoncentráció magas titerű vírusállományokhoz
• Víruskoncentráció Amicon ^{segítségével® Ultra Centrifugal Ultrafiltration Devices}
• Conclusions
• Centrifugális ultraszűrő eszközök

Vírusok izolálása, terjedése és jellemzése

1. ábra. Ultraszűrés a vírus koncentrálásához. A folyadék áthalad a membránszűrőn, miközben a nagy vírusrészecskék visszatartódnak.

A vírusizolációs és -szaporítási módszerek kritikus fontosságúak a kutatás, a vakcinagyártás és a diagnosztikai munkafolyamatok során. Az alapkutatási laboratóriumok vírusállományokat használnak a vírusbiológia és a patogenezis tanulmányozására. Az oltóanyag-előállításhoz kis- és nagyléptékű víruselőkészítésre van szükség. És bár a legtöbb diagnosztikai laboratórium ma már nem tenyésztett módszereket használ a vírusbetegségek diagnosztizálásához, a vírusizolálás sejtkultúrában továbbra is hasznos megközelítés, ha életképes izolátumokra van szükség, ha életképes és nem életképes vírusokat kell megkülönböztetni, és olyan esetekben, amikor a kultúraalapú módszerek gyorsabb eredményeket tudnak szolgáltatni, mint a nem kultúrás módszerek.

A vírusokat sejtkultúrában lehet szaporítani vírusállományok előállítása céljából. A tenyésztett sejteket beoltják magvavírusból, kereskedelmi forrásból vagy fertőzött szövetből származó vírusállományokkal. Az inkubációt követően a fertőzött sejteket lizálják a vírusrészecskék kinyerése céljából, vagy a felszabaduló vírust közvetlenül a sejtek felülúszójából nyerik ki. A víruskészletet ezután megtermelik, aliquotálják és -80 °C-on tárolják későbbi felhasználás céljából.

A vírus klinikai mintákból történő izolálása szintén a sejtkultúrát használja ki a vírusszaporításra. A klinikai mintákat a minta homogenizálásával és folyékony közegbe történő extrakcióval készítik elő, amelyet aztán centrifugálnak és sejttenyészetek beoltására használnak.

A magas titerű víruskészletek elérése érdekében a megtisztított vírusrészecskéket koncentrálni kell. A virionok és vírusoldatok koncentrálására az Amicon^® Ultra és Centricon^® Plus centrifugális ultraszűrő berendezések regenerált cellulózmembránnal használhatók (1. ábra). Ez a protokoll az Amicon^® és Centricon^® centrifugális ultraszűrő készülékek használatát írja le három gyakori vírustípus koncentrálására: lentivírus, adenovírus és adeno-asszociált vírus (AAV).

Általános módszer a vírusszaporításra

1. A sejtek csomagolása: A gazdasejteket 80-85%-os konfluencia eléréséig telepítettük.
2. Transzfekció: A sejteket életképes vírusrészecskékkel fertőztük.
3. Vírusszüret: A vírustól függően a rekombináns virionok tisztítására vagy a sejtek felülúszóját, vagy pelletált sejteket, vagy mindkettőt használtuk. Négy fagyasztási/olvasztási ciklust alkalmaztunk a vírus sejtekből való felszabadítására. A sejttörmeléket ezután centrifugálással választottuk el a sejtlizátumtól. 
   
4. Vírustisztítás: A vírust a sejtlizátumból sűrűséggradiens ultracentrifugálással vagy oszlop/membrán kromatográfiával tisztítottuk.
5. A tisztított vírusoldatokat koncentráltuk és puffercseréltük megfelelő tárolóoldatba passzív dialízis, diafiltráció vagy centrifugális ultraszűrés segítségével Amicon^® Ultra és Centricon^® Plus 70 készülékekkel.

Víruskoncentráció a magas titerű víruskészletekhez

A magas titerű víruskészletek előállításához a tisztított vírus centrifugális ultraszűréssel koncentrálható. A készülék, a membránanyag, a molekulatömeghatár vagy cut-off, a centrifugálási sebesség, a centrifugálási idő és a puffer összetételének helyes megválasztása kritikus fontosságú a fertőző vírusrészecskék magas visszanyeréséhez. Az Amicon^® Ultra centrifugális ultraszűrő készülékek a szűrőmembránjuk által meghatározott névleges molekulatömeghatárral (NMWL) rendelkeznek. Az Amicon^® Ultra centrifugális ultraszűrő készülékeket az 50 kDa NMWL Ultracel^® -vel 50 kDa NMWL Ultracel^® -t használták adenovírus és adeno-asszociált vírus (AAV) oldatok koncentrálására. A lentivírus koncentrálásához 50 kDa és 100 kDa NMWL membránnal ellátott eszközöket használtak.

Az ultraszűrési módszer és a membránok névleges molekulatömegének kiválasztásakor figyelembe veendő tényezők:

1. Vírusrészecskék mérete: A méret becsülhető publikált forrásokból, vagy olyan mérési technikákkal, mint a mikroszkópia, a lézerdiffrakció és a dinamikus fényszórás.
2. A fő elválasztási célpontok mérete az oldatban: Az elválasztandó fehérjék, antitestek, gyógyszerek, vegyi anyagok és egyéb részecskék mérete befolyásolja a membránméret kiválasztását.
3. Mintatérfogat: A ≤0,5 mL-től 70 mL-ig terjedő feldolgozási térfogatok kompatibilisek a centrifugális ultraszűrő (cUF) eszközökkel.

A vírusrészecskék visszatartásához a szűrőmembrán molekulatömeghatárának kisebbnek kell lennie, mint a részecskének (~2-szer kisebbnek, mint a vírusrészecske molekulatömege), de elég nagynak ahhoz, hogy a kisebb komponenseket átszűrje
(1. táblázat).

1. táblázat. Az ultraszűrő membrán NMWL kiválasztása a vírusrészecskeméret alapján.

Ultrafiltrációs membrán NMWL (kDa)	Nominális pórusméret (nm)	Nominális pórusméret (nm)	Receptált ultraszűrési névleges visszatartó pórusmérettartomány
			átmérő (nm)		Molekulatömeg (kDa)
Minimum	<Maximum	Minimum Maximum	Maximum
3	0.3	1	1.5	6	20
10	1	3	9	20	90
30	3	9	15	60	180
50	5	15	30	100	300
100	10	30	90	200	900

Víruskoncentráció Amicon^® Ultra centrifugális ultraszűrő készülékekkel

A 2. táblázat az adenovírus, lentivírus és AAV koncentrációjának eredményeit mutatja mind a nyers sejtlizátumból, mind a kromatográfiával tisztított vírusból. A vírusrészecskéket hatékonyan koncentrálták magas titerre, magas visszanyerési értékekkel az Amicon^® Ultra centrifugális ultraszűrő eszközökkel.

2. táblázat. A vírus koncentrálása ultraszűrő eszközökkel. Nem javasoljuk a vírus koncentrálását 1013 részecske/ml-nél magasabb koncentrációra a vírus esetleges aggregációja miatt.

Kezdési minta	Készülék	Kezdési vírustiter	Kezdési térfogat (ml)	Koncentrációs tényező	Pörgetési idő 1500 x g-nél (perc)	Recovery (%)
Adenovírus a nyers sejtlizátumban		Amicon®< Ultra-4 50 kDa	1 x 108	4	27X		20	>100
Adenovírus tisztítva, 1M sós pufferben	Amicon® Ultra-4 50 kDa		Amicon® Ultra-4 50 kDa	1 x 108	4	45X	10	85
AAV a nyers sejtlizátumban	Amicon® Ultra-4 50 kDa	2 x 10	2 x 10	4	20X	35	50
AAV nyers sejtlizátumban	Amicon®Ultra-15 50 kDa	2 x 107	10	25X	>45		76
AAV 100 mM Tris, 250 mM NaCl pufferben hígítva<	Amicon® Ultra-4 50 kDa	5 x 106	4	20X	20	100
Lentivírus a sejtkultúra felülúszójában	Amicon® Ultra-4 100 kDa	9 x 10 4	4	100X	100X	30	>100
Lentivírus a sejtkultúra felülúszóban	Amicon®	./sup> Ultra-4 50 kDa	9 x 104	4	100X		30	93
Lentivírus sejtkultúra felülúszóban	Centricon Plus-70 100 kDa	8 x 103	65	80X	30	81

Nem szabad elfelejteni, hogy a legtöbb vírust nem lehet hatékonyan koncentrálni és tárolni alacsony sótartalmú pufferekben. A vírus centrifugális koncentrálása < 250 mM sóoldatokban vírusaggregációhoz és csökkent fertőzőképességhez vezet.

A koncentrált vírusállomány szűrősterilizálható 0.22 µm-es szűrőkön. Ultrafree^®-MC GV szűrőegységek használható < 0.5 ml.

Következtetések

Módszert dolgoztunk ki az ultraszűrés validálására az Amicon® Ultra és Centricon^® Plus centrifugális eszközökkel, mint a vírusok magas titerének elérésének gyors és költséghatékony eszközét. Ez a módszer használható vírusok koncentrálására sejttenyésztési felülúszóból, sejtlizátumból és más forrásokból. A koncentrálás után a vírusállomány szűrősterilizálható Ultrafree^® szűrőegységek segítségével. A fertőző vírusrészecskék legnagyobb mértékű visszanyerése érdekében kritikus fontosságú a megfelelő ultraszűrő készülék, membránszűrő, molekulatömeg-határérték (MWCO), centrifugálási sebesség és centrifugálási idő kiválasztása.

Centrifugális ultraszűrő készülékek

.

Készülék névleges molekulatömeghatár, NMWL (kDa)	Amicon® Ultra centrifugális ultraszűrő készülékek					Centricon® Plus 70 centrifugális készülékek
	0.5 ml	2 ml	4 ml	<./td>	15 ml	15 - 70 ml
3	UFC5003		UFC8003	UFC9003	UFC9003	UFC7003
10	UFC5010	UFC2010	UFC8010	UFC9010	UFC7010
10 (IVD*)			UFC4010D*	UFC9010D*
30	UFC5030	UFC2030	UFC8030	<UFC9030	UFC7030
50	UFC505050	UFC2050	UFC8050	UFC8050
100	UFC5100	UFC2100	UFC8100	UFC9100	<UFC7100

* IVD felhasználásra regisztrálva