Ganzgenom-Amplifikation (WGA) für die Biologie von Einzelzellen
Einleitung
Die ultimative biologische Einheit liegt in einer einzelnen Zelle. Viele biologische Disziplinen haben sich zum Ziel gesetzt, die Ursachen der Zelldifferenzierung auf dieser Ebene zu erforschen. Die geheimen Auslöser, welche die menschliche Reifung, Regeneration und genetische Krankheiten signalisieren, liegen alle in einer einzigen Zelle, die ursprünglich Teil eines genetisch klonalen, mehrzelligen Organismus war. Trotz sorgfältiger Arbeit mit hochentwickelten Instrumenten, die für die Dissektion von Gewebeproben zur Verfügung stehen, weisen mehrere Studien darauf hin, dass gepoolte Zellproben, die als homogen gelten, oft aus Zellen mit ganz unterschiedlichen Phänotypen bestehen.1
Die Entwicklung und Kommerzialisierung erschwinglicher Geräte für die Biologie von Einzelzellen, deren Einsatz leichter zu gestalten ist, ermöglicht es einem größeren Forscherkreis, dieses neue Gebiet zu erforschen. Dazu gehören Vorrichtungen zur Isolierung einzelner Zellen, wie fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, Lasermikrodissektion, optische Pinzetten und Rasterkraftmikroskopie. Sobald Einzelzellproben einfach verfügbar waren, konnten Anwendungen wie die In-situ-Fluoreszenzhybridisierung oder FISH3 eingesetzt werden, um die Unterschiede zwischen den Populationen einzelner Zellen zu ermitteln. Dies hat zu einem massiven Anstieg von Arbeiten und Spekulationen auf dem Gebiet der Einzelzellbiologie geführt.4-6
Die Anpassung von Mehrzell-/Gewebeverfahren an Einzelzelluntersuchungen ist aufgrund technischer Unzulänglichkeiten - meist Probleme im Zusammenhang mit der Empfindlichkeit - oft nur von begrenztem Nutzen. Trotz des großen Potenzials der genomischen Einzelzellanalyse beschränkte sich das Feld bisher auf die vergleichende Analyse relativ weniger genomischer Orte für eine große Anzahl von Einzelzellisolaten. Mit Techniken wie FISH oder Einzelzell-PCR kann nur eine kleine Anzahl von DNA-Sequenzen untersucht werden, bevor die Zelle zerstört wird. Ebenso hat die geringe Probengröße einer einzelnen Zelle bisher nur eine begrenzte Untersuchung der Genexpression, des Proteomaufbaus und der Charakterisierung von Zellmetaboliten ermöglicht.
Die Ganzgenom-Amplifikation (WGA) bietet eine Möglichkeit, die vorgenannten Einschränkungen für genomische Einzelzellanalysen zu überwinden. Die WGA wird als unspezifische Amplifikationstechnik beschrieben, die ein vollständig repräsentatives amplifiziertes Produkt des Ausgangsmaterials liefert. In der Literatur sind drei verschiedene Strategien für WGA beschrieben.
Historie
Die Linker-Adapter-PCR wurde erstmals 1989 beschrieben.9 Bei dieser Methode wird die Ziel-DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut und anschließend jedes Ende an einen Adapter ligiert. Diese bekannten Adaptersequenzen werden verwendet, um jedes der vielen DNA-Fragmente, welche die ursprüngliche Probe darstellen, einheitlich zu amplifizieren. Die Methode beruht auf einer absolut effizienten Ligation und einer Amplifikation ohne systematische Fehler zwischen den identischen geprimten Regionen (siehe Abbildung 1).
Abbildung 1.Linker-Adapter-PCR-Mechanismus
Bei der Primer-Verlängerungs-Präamplifikations- (PEP) PCR wird dagegen eine Reihe von zufälligen Hexameren verwendet, um die Template-DNA zu primen.10 Unter den anschließenden thermischen Zyklusbedingungen werden sehr niedrige (permissive) Hybridisierungstemperaturen und fünfzig oder mehr Zyklen verwendet, um eine Reihe von Fragmenten zu erzeugen, welche die ursprüngliche Eingabe-DNA repräsentieren. Systematische Fehler im resultierenden PEP-PCR-Produkts sind auf die Ungleichmäßigkeit der Hybridisierung und Verlängerung der zufälligen Hexamere zurückzuführen - DNA-Abschnitte mit seltenen oder weit entfernten Priming-Ereignissen werden bei dieser Methode tendenziell diskriminiert. Diese Unzulänglichkeiten wurden mit der Multidisplacement-Amplifikation (MDA) weitgehend überwunden.11 Bei der MDA-Technik wird eine einzigartige und hochgradig prozessive mesophile DNA-Polymerase, phi29, verwendet. Das resultierende Produkt besteht aus langen Fragmenten (10-50 kb), die jedoch gut amplifiziert und dargestellt werden (siehe Abbildung 2).
Abbildung 2.Multidisplacement-Amplifikation (MDA)
Die PCR mit degenerativen Oligonukleotid-Primern (DOP), die auch als Arbitrary-PCR bezeichnet wird, stützt sich auf eine Reihe von Oligos mit einem zufälligen 3'-Ende und einer teilweise fixierten 5'-Sequenz.12 Diese Primer sind so konzipiert, dass sie relativ gleichmäßig in der gesamten DNA-Probe hybridisieren. Nach der Verlängerung durch eine Polymerase werden diese Produkte mit Hilfe von Oligos, die auf ihre festen Sequenzen abzielen, amplifiziert. Das Primerdesign ist für diese Technik entscheidend - das Oligo muss relativ gleichmäßig an die DNA-Sequenz binden, darf aber nicht an andere Oligonukleotide binden. Diese Methode wurde auch erfolgreich angewandt, um repräsentative Proben zu erhalten (siehe Abbildung 3).
Abbildung 3.Mechanismus für PCR mit degenerierten Oligonukleotid-Primern
Einzelzellanalyse
Jede dieser Techniken wurde auf das Problem der Amplifizierung des genetischen Materials in einer einzelnen Zelle angewandt, und das mit einigem Erfolg. Die PEP-PCR war die erste Methode, die für die WGA von Einzelzellen eingesetzt wurde. Sie wurde in mehreren nachfolgenden Anwendungen erfolgreich angewandt.13-14 Eine von Rubicon Genomics entwickelte Variante der DOP-PCR wurde für die Amplifikation einzelner Chromosomen verwendet,15 kurz darauf folgte die Verwendung einer Linker-Adapter-PCR-Methode, ebenfalls, um ein einzelnes Chromosom vollständig zu amplifizieren.16 Schließlich wurde die MDA mit phi29 für die Amplifikation einer Reihe von Einzelzellen verwendet.8,17
WGA-Methoden unterscheiden sich in zweierlei Hinsicht: in Bezug auf das Ausmaß systematischer Fehler im Produkt bei Verwendung begrenzter Mengen Eingabe-Template und die Qualitätsanforderungen an das Eingabematerial. Das vorherige Problem, das sich bei Einzelzellanwendungen als offensichtlicher Informationsverlust oder Allelausfall (ADO) manifestiert, ist vermutlich auf die ungleiche lokale Verteilung der Reagenzien in der Nähe des Ziels zurückzuführen.28 Das zweite Phänomen hängt von der Methode und der Tatsache ab, dass geschädigte DNA dazu führen kann, dass bestimmte Orte nicht mehr amplifizierbar sind.
WGA-Methoden wie MDA, mit denen lange Amplikons erzeugt werden, können weniger robust sein, da es notwendigerweise nur wenige Priming-Ereignisse gibt und daher jeder Fehler in einem langen Amplikon einen relativ großen Informationsverlust verursacht. WGA, die kurze Amplikons erzeugen, wie PEP-PCR, Linker-Adapter-Amplifikation und DOP-PCR, verlieren unter diesen Umständen weniger Informationen.
Sowohl die DOP-PCR als auch die MDA-Amplifikation sind inzwischen in kommerziellen Kits für die Molekularbiologie erhältlich, aber nur das von Sigma-Aldrich angebotene GenomePlex® Kit wurde speziell für Einzelzellanwendungen entwickelt. Die Technik baut auf einer Produktlinie auf, die zuerst von Rubicon eingeführt und im Herbst 2004 von Sigma-Aldrich als alleinigem Lizenznehmer und Vertriebshändler übernommen wurde. Seitdem hat Sigma-Aldrich vier WGA-bezogene Produkte entwickelt, darunter das ursprüngliche Kit (WGA1),ein Kit mit einer optimierten DNA-Polymerase (WGA2), ein Kit zur Reamplifikation von WGA-DNA (WGA3) und ein Kit für Einzelzellanwendungen (WGA4). Das Herzstück dieser Produktlinie ist eine PCR-basierte WGA-Methode, in der degenerierte Oligonukleotide gekoppelt mit Universaladaptern in einer Kombination aus PEP- und DOP-Amplifikationsmethoden eingesetzt werden. GenomePlex kann 10 ng genomischer DNA in etwa drei Stunden zuverlässig amplifizieren.
Das im Februar 2006 vorgestellte WGA-Kit für Einzelzellen ermöglicht eine millionenfache Amplifikation einer durchflusssortierten oder mit Laser-Mikrodessektion ausgeschnittenen Einzelzelle, was zu einer Endausbeute von etwa 5 μg führt. Die Einzelzellmethode unterscheidet sich in dreierlei Hinsicht vom ursprünglichen Kit. Zum einen enthält WGA4 ein Zelllyseprotokoll, in dem ein effizientes Lyseverfahren mit der ursprünglichen Fragmentierung kombiniert wird. Zweitens wird bei den anschließenden isothermen Bibliotheksvorbereitungsschritten ein neu optimierter Primer verwendet, der eine bessere Abdeckung bei niedrigem Template bietet, aber eine geringe Selbst-Hybridisierung und damit eine nicht nachweisbare Primer-Elongation sicherstellt. Schließlich wurde das Protokoll für die Amplifikationszyklen dahingehend geändert, dass mehr Zyklen verwendet werden, wodurch eine größere Gesamtamplifikation erreicht wird. Das Einzelzell-WGA-Produkt wurde unter Verwendung von 96 separaten SYBR ® Green qPCR-Orten getestet und weist nachweislich einen zufälligen Allelausfall (ADO) von 25-33 % auf. Die Arbeit der Einzelzell-WGA wurde mit mehreren Beta-Testern unter Verwendung von STR-Analysen, RPLF-Assays, quantitativer PCR und Microarray-Analysen validiert.
Fortschritte in der Einzelzell-WGA werden es den Forschern ermöglichen, den Beitrag der Genomik zur Einzelzellbiologie sichtbar zu machen. Insbesondere die Krebs- und Arzneimittelforschung im Bereich der Genomik birgt das größte Potenzial für diese Chance. Chromosomenaberrationen als Folge von Krebs könnten besser katalogisiert werden, wenn eine einzelne Krebszelle mit ihrem normalen Gegenstück verglichen würde. Darüber hinaus kann der Vergleich einzelner Zellen aus der "behandelten" mit der "unbehandelten" Population zur Bewertung der genomischen Auswirkungen für das Screening von Wirkstoffkandidaten genutzt werden.
Das Verstehen von Unterschieden auf der Ebene einer einzelnen Zelle ist das ultimative Ziel der Biologie. Neue kommerzielle Techniken, wie die Einzelzell-WGA, eröffnen neue Möglichkeiten für weitere Studien. Im Hinblick auf die empfindliche Amplifikation von Einzelzell-RNA ohne systematische Fehler, welche die Expression von Einzelzellgenen ermöglicht, wurden bereits beträchtliche Anstrengungen unternommen7,22-27. Und es wurden in diesem Bereich bereits kommerzielle Kits entwickelt, um diesem Kundenbedarf gerecht zu werden. Durch die Entwicklung weiterer Wege zur Erforschung von Epigenetik, Proteomik,18-19 Metabolomik und zellulärer Signaltransduktion20-21 wird sich dann den Wissenschaftlern die ganze Welt der Einzelzellbiologie erschließen.
Literatur
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