Hot-Start-PCR

• Was ist Hot-Start-PCR?
• Hot-Start-PCR-Protokoll
• Die Vorteile von Hot-Start-PCR, Nested-PCR (geschachtelte PCR) und Multiplex-PCR
• KOD Hot-Start-DNA-Polymerase und Mastermix
• FastStart™ Taq-DNA-Polymerase und High Fidelity PCR-System
• JumpStart™ Taq-ReadyMix™ und Taq-DNA-Polymerase
• AptaTaq™ Fast-DNA-Polymerase und AptaTaq™ Fast-PCR-Master

Was ist Hot-Start-PCR?

Hot-Start-PCR ist eine Technologie, durch welche die Aktivität der Hot-Start-Taq-Polymerase oder der Einbau modifizierter dNTP beim Reaktionsaufbau gehemmt wird, bis eine Wärmeaktivierung stattfindet. Hot-Start-PCR ermöglicht den Reaktionsaufbau bei Raumtemperatur ohne unspezifische Amplifikation und Primer-Dimer-Bildung. Bei der konventionellen PCR werden häufig exponentielle Kopien der DNA-Zielsequenz ohne eine zusätzliche, temperaturempfindliche Reaktionsaktivierungskomponente hergestellt.

Für PCR-Reaktionen sind mehrere wichtige Reagenzien erforderlich, darunter die Template-Sequenz für die Amplifikation, dNTP, Puffer und Taq-DNA-Polymerase, um den Einbau der dNTP enzymatisch zu erleichtern und schließlich neue Kopien der Zielsequenz zu erstellen. Das Grundprinzip der Hot-Start-PCR-Methoden und -Reagenzien besteht darin, dass sie die Aktivität der Hot-Start-Taq-DNA-Polymerase bzw. den Einbau modifizierter dNTP während des Reaktionsaufbaus hemmen, bis ein Wärmeaktivierungsschritt erfolgt. Es gibt verschiedene Methoden zur Hemmung der Hot-Start-Polymeraseaktivität, wie z. B. chemische Modifikation, antikörpervermittelte und aptamervermittelte Methoden. Weitere Informationen finden Sie in unserem informativen Hot-Start PCR-Video, in dem die Hot-Start-PCR-Technologie näher erläutert wird und wie sie die Zielspezifität und Ausbeute verbessern kann.

Hot-Start-PCR-Protokoll

• Antikörpervermitteltes Hot-Start-PCR-Protokoll
• dNTP-vermitteltes Hot-Start-PCR-Protokoll

Die Vorteile von Hot-Start-PCR, Nested-PCR (geschachtelte PCR) und Multiplex-PCR

Zu den Vorteilen der Hot-Start-PCR gehören die bequeme Einrichtung bei Raumtemperatur ohne unspezifische Amplifikation und die Bildung von Primer-Dimeren, die beide die Spezifität der Zielsequenz und die Gesamtausbeute verringern können.  Bei alternativen PCR-Methoden, wie z. B. Nested-PCR oder Multiplex-PCR, werden unterschiedliche Reagenzien und Strategien verwendet, um Spezifität und hohe Ausbeuten für ein oder mehrere Amplikon(s) zu erzielen. Bei der Nested-PCR werden zwei Primersätze verwendet, wobei der erste Satz die Sequenzen direkt außerhalb der Zielsequenz für die erste Amplifikationsrunde flankiert. Der zweite Primersatz ist spezifisch für die Zielsequenz aus der ersten Runde, die dann als Template für die zweite PCR-Runde mit den verschachtelten Primern verwendet wird. Bei der Multiplex-PCR werden mehrere Sätze hochspezifischer Primer verwendet, um mehrere Zielsequenzen gleichzeitig in derselben Reaktion zu amplifizieren. Jede PCR-Methode bietet eine Reihe von Vorteilen und sollte je nach den spezifischen Anforderungen durch den Forscher ausgewählt werden.

KOD Hot-Start-DNA-Polymerase und Mastermix

Die KOD Hot-Start-DNA-Polymerase ist ein vorgemischter Komplex aus KOD DNA-Polymerase, in dem zwei hochspezifische monoklonale Antikörper zur Hemmung der 3′→5′-Exonukleaseaktivität bei Raumtemperatur verwendet werden. Durch die Beseitigung von Mispriming und Primer-Dimer-Bildung ist die KOD Hot-Start-DNA-Polymerase ein ideales Reagenz für die Amplifikation langer Stränge genomischer DNA-Templates (bis zu 12 kb), Plasmid- und Lambda-DNA-Templates (bis zu 21 kb). Mit einem optimierten Enzym für die PCR-Amplifikation von langen und GC-reichen Templates amplifiziert die KOD Xtreme Hot-Start-DNA-Polymerase erfolgreich Templates aus rohen oder schwer zu amplifizierenden Proben, einschließlich Pflanzengewebe und Mausschwanzspitzen. Darüber hinaus bietet unser KOD Hot-Start-Mastermix eine umfassende Lösung durch die Kombination aus KOD Hot-Start-DNA-Polymerase, dNTP und optimiertem Reaktionspuffer in einer gebrauchsfertigen 2X-Mischung.

Genomische und Lambda-DNA-Amplifikation mit KOD Hot-Start

Die Abbildung links zeigt die genomische DNA-Amplifikation mit der KOD-Hot-Start DNA-Polymerase des menschlichen Myosin-Schwerketten-Gens (8,4 kb) und des menschlichen β-Globin-Gens (12,3 kb). Die Abbildung rechts zeigt, dass Lambda-DNA mit geeigneten Primern und KOD Hot-Start-DNA-Polymerase amplifiziert wurde. M = Marker

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FastStart™ Taq-DNA-Polymerase und High Fidelity PCR-System

FastStart™ Taq-DNA-Polymerase ist ideal für die Hot-Start-PCR-Amplifikation von Einzelzielen und für Multiplex-Anwendungen. Zusätzlich wird im FastStart™ High Fidelity PCR-System eine Mischung aus FastStart™ Taq-DNA-Polymerase und einem chemisch modifizierten, thermostabilen Korrekturleseprotein eingesetzt. Sowohl die FastStart™ Polymerase als auch das Protein mit Korrekturlesefunktion sind unterhalb von 75 °C inaktiv und werden nach nur zweiminütigem Erwärmen auf 95 °C durch die Entfernung der Blockierungsgruppen aktiviert.

Amplifikation menschlicher genomischer DNA mit dem FastStart™ High Fidelity PCR-System

Menschliche genomische DNA wurde für die Amplifikation eines 4,8 kb großen Fragments des tPA-Gens verwendet. Das FastStart™ High Fidelity PCR-System zeigte eine höhere Sensitivität und Spezifität als Enzyme von zwei anderen Anbietern.

JumpStart™ Taq-ReadyMix™ und Taq-DNA-Polymerase

Durch die antikörpervermittelte Inhibition wird JumpStart™ Taq-Polymerase erst aktiviert, wenn die Reaktion 70 °C erreicht und der Antikörper vom Enzym dissoziiert. Der Antikörper-Enzym-Komplex ermöglicht eine bequeme Einrichtung bei Raumtemperatur mit reduzierter unspezifischer Amplifikation für Standard-Hot-Start-PCR, qPCR und Multiplex-PCR. Darüber hinaus sind im JumpStart™ Taq ReadyMix™ die gleichen Eigenschaften der JumpStart™ Enzyme mit allen übrigen Komponenten kombiniert, die für die PCR benötigt werden und die in der ReadyMix™ PCR-Reaktionsmischung enthalten sind, mit dem optionalen Zusatz eines inerten Gelladefarbstoffs.

Lambda-Phagen-Amplifikation mit JumpStart^™ REDTaq^® ReadyMix^™ Reaktionsmischung

200 ng Lambda-Phagen-DNA wurden mit dem JumpStart REDTaq ReadyMix™ von Sigma (ungerade nummerierte Bahnen) und dem Direct Load ReadyMix des Mitbewerbers (gerade nummerierte Bahnen) amplifiziert.

AptaTaq™ Fast-DNA-Polymerase und AptaTaq™ Fast-PCR-Master

Während in alternativen Hot-Start-PCR-Reagenzien antikörpervermittelte Methoden oder chemisch modifizierte DNA-Taq-Polymerasen eingesetzt werden, beinhaltet AptaTaq™ Fast-DNA-Polymerase die Aptamer-Technologie, um die unspezifische Anwendung während des Reaktionsaufbaus bei Raumtemperatur zu hemmen. Darüber hinaus enthält der AptaTaq™ Fast-PCR-Master die aptamervermittelte Hot-Start-Taq-Polymerase und alle Reagenzien mit Ausnahme des DNA-Templates und der Primer für einen schnellen Reaktionsaufbau und noch schnellere Reaktionszeiten. Die bei Temperaturen über 70 °C aktivierte AptaTaq™ Fast-DNA-Polymerase ist ideal für spezifisches Priming und schnelle PCR-Anwendungen.

PCR-Amplifikation mit AptaTaq™ Fast-PCR-Master

PCR-Reaktionen unter Verwendung von AptaTaq™ Fast-PCR-Master lassen auf eine überlegene Amplifikation im Vergleich zu Mastermischungen von Mitbewerbern schließen.