Optimierung der qPCR-Bedingungen
Die Optimierung der qPCR-Bedingungen ist wichtig für die Entwicklung eines robusten Assays. Anzeichen für eine schlechte Optimierung sind mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten sowie ineffiziente und unempfindliche Assays. Die beiden wichtigsten Ansätze sind die Optimierung der Primerkonzentration und/oder der Hybridisierungstemperaturen.
Ein Ansatz zur Optimierung der Primerkonzentrationen ist die Erstellung einer Reaktionsmatrix. Sie wird verwendet, um eine Reihe von Konzentrationen für jeden Primer im Abgleich zu verschiedenen Konzentrationen des Partnerprimers zu testen. Im Beispiel, das in diesem Protokoll enthalten ist, wird eine 6×6-Matrix mit sechs Konzentrationen (z. B. 50 nM bis 800 nM) getestet. Die in diesem Protokoll angegebenen Mengen erlauben es, jede Bedingung in zweifacher Ausführung durchzuführen.
Für das Protokoll zur Optimierung der Primerkonzentration verwendete Ausrüstung
- Gerät für die quantitative PCR
- Laminar-Flow-Werkbank für PCR-Setup (optional)
Reagenzien
- Geeignetes Assay-Template, z. B. 1:10 verdünnte cDNA, gDNA oder synthetisches Oligo-Template.
- KiCqStart® SYBR® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03 - abhängig vom Gerät, siehe Tabelle P4-6 in Bezug auf Instrumentenkompatibilität).
- Wasser in PCR-Qualität: Wasser in PCR-Qualität (W1754 oder W4502) in 20 ml-Aliquoten; gefrieren; für jede Reaktion ein frisches Aliquot verwenden.
- Konzentrierte Stammlösung für Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 μM Arbeitslösung:
- Kundenspezifische Oligos können unter sigmaaldrich.com/oligos bestellt werden.
Materialien
- Sterile Filter-Pipettenspitzen
- Sterile 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (CLS430909)
- PCR-Röhrchen und -Platten - Treffen Sie ihre Auswahl, um das gewünschte Format zu erhalten:
• Einzelne dünnwandige 200-μl-PCR-Röhrchen (Z374873 oder P3114)
• Platten
- 96-Well-Platten (Z374903)
- 384-Well-Platten (Z374911)
• Plattendichtungen
- ThermalSeal RTS™ Dichtfilme (Z734438) - ThermalSeal RT2RR™ Film (Z722553)
Anmerkungen zu diesem Protokoll
- Die cDNA wird mit Hilfe eines Zufallsprimers oder einer Oligo-dT-Priming-Methode erzeugt und für die Verwendung 1:10 verdünnt. Darüber hinaus kann jedes geeignete alternative Template verwendet werden.
- Alle Proben werden in zweifacher Ausführung entsprechend dem Plattenlayout (Abbildung P13-18) durchgeführt.
Abbildung P13-18.Schematische Darstellung des Plattenlayouts für die Primer-Optimierung
Methode
Hinweis: 2.0 μl jedes Primers werden zu der Reaktion mit einem Gesamtvolumen von 20 μl hinzugefügt. Damit die gewünschte Endkonzentration erreicht wird, sind die Werte der Primer-Stammlösungen 10-mal so hoch wie die erforderliche Konzentration.
1. Unter Verwendung der 10 μM-Primer-Stammlösungen wird eine Verdünnung der beiden Primer-Stammlösungen auf 0,5, 1, 2, 4, 6 und 8 μM gemäß Tabelle P13-32 vorgenommen.
2. Es wird ein qPCR-Mastermix gemäß Tabelle P13-33 vorbereitet
(Hinweis: Template und cDNA werden in Schritt 5 separat hinzugefügt). Gut mischen.
*Hinweis: Fügen Sie cDNA und Primer nicht vor Schritt 5 hinzu.
3. Entnehmen Sie 184,8 μl (für 12× NTC) des Mastermix aus Schritt 2 in ein separates Röhrchen, um die Negativkontrolle (NTC) vorzubereiten.
4. Fügen Sie 26,4 μl dH2O zu der NTC-Mischung aus Schritt 3 hinzu (um das Template zu ersetzen).
Hinweis: Die NTC-Mischung zur späteren Verwendung auf Eis legen.
5. Fügen Sie 158,4 μl cDNA-Template zum restlichen Mastermix aus Schritt 2 hinzu. Mastermix auf Eis legen.
6. Geben Sie 2,0 μl der entsprechenden Rückwärtsprimer-Verdünnungen gemäß Abbildung P13-18 in die PCR-Platte; fügen Sie der NTC-Reihe ebenfalls eine Konzentration von 800 nM hinzu.
7. Geben Sie 2,0 μl der entsprechenden Vorwärtsprimer-Verdünnungen gemäß Abbildung P13-18 in die PCR-Platte.
8. Aliquotieren Sie 16 μl des Mastermix aus Schritt 5 in die PCR-Platte in die den Testpositionen entsprechenden Wells.
9. Aliquotieren Sie 16 μl Mastermix aus Schritt 4 für NTC-Reaktionen in die PCR-Platte.
10. Platten versiegeln und beschriften. (Vergewissern Sie sich, dass die Beschriftung nicht den Anregungs-/Detektionslichtweg des Instruments verdeckt).
11. Führen Sie die Proben gemäß dem zweistufigen Protokoll in Tabelle P13-34 durch. Die Schritte 1 und 2 werden mit 40 Zyklen wiederholt, gefolgt von einer Dissoziationskurvenanalyse.
Hinweis: Verwenden Sie das Standardprotokoll für Dissoziationskurven (Datenerfassung).
Um weiterzulesen, melden Sie sich bitte an oder erstellen ein Konto.
Sie haben kein Konto?