Stříbrné nanomateriály pro biologické aplikace

Steven J. Oldenburg*, Aaron E. Saunders

nanoComposix, Inc., San Diego, California 92111 *

steve.oldenburg@nanocomposix.com

Stříbrné nanomateriály mají jedinečné fyzikální, chemické a optické vlastnosti, které se v současné době využívají pro nejrůznější biologické aplikace. Oživení zájmu o užitečnost stříbra jako  antimikrobiálního prostředku s širokou působností vedlo k  vývoji stovek výrobků, které obsahují nanočástice stříbra, aby zabránily  růstu bakterií na povrchu. Nanočástice stříbra mají navíc  optickou barvu, která je funkcí jejich velikosti a tvaru. Silná vazba nanočástic stříbra na specifické vlnové délky dopadajícího světla může být využita k vývoji ultrajasných reportérových molekul, vysoce účinných tepelných absorbérů a "antén" v rozměrech nanoměřítka, které mohou zesilovat sílu místního elektromagnetického pole. Zde shrnujeme, jak přesné  inženýrství velikosti a tvaru nanočástic stříbra umožňuje širokou škálu  biologických aplikací.

Povrchová chemie, morfologie a optické vlastnosti nanomateriálů stříbra

Reakční podmínky při syntéze nanomateriálů stříbra lze vyladit tak, aby vznikly koloidní nanočástice stříbra s různou morfologií, včetně monodisperzních nanosfér, trojúhelníkových hranolů, nanoploch, krychlí, drátků a nanorodů. Pro použití v biologických aplikacích musí být povrchová chemie, morfologie a optické vlastnosti nanočástic stříbra pečlivě kontrolovány, aby bylo dosaženo požadované funkčnosti v cílovém prostředí.

Povrchová chemie

V mnoha biologických aplikacích je žádoucí vyladit koloidní stabilitu v různých pufrech nebo médiích nebo měnit vazbu částic či jejich příjem prostřednictvím povrchových interakcí. Povrchovou chemii částic (tj. sílu vazby, funkční skupiny a velikost obalových činidel) lze měnit a zajistit tak další úroveň kontroly nad chováním částic. Ve vodných prostředích je mnoho nanočástic elektrostaticky stabilizováno přidáním nabitých látek na povrch částic. Typ a hustotu  nábojů lze určit měřením zeta potenciálu  koloidu. Typicky je zeta potenciál nanočástic stříbra záporný díky molekulám vázaným na povrchu, jako je citrát. Vystavením nanočástice těsněji koordinujícím ligandům (často obsahujícím thiolovou nebo aminovou funkci) se mohou na povrch navázat nová uzavírací činidla a  změnit chemickou funkci a zeta potenciál nanočástice.Nahrazení citrátových iontů krátkými řetězci s methoxy-koncovkami  molekul polyethylenglykolu (mPEG) poskytuje zeta potenciál blízký  neutrálnímu, zatímco potažení částic rozvětveným polyethyleniminem (BPEI)  vytváří povrch s hustým obsahem aminů a vysoce pozitivním zeta potenciálem.

Morfologie a optické vlastnosti

Stříbro a další nanočástice ušlechtilých kovů vykazují silnou interakci se světlem, protože elektrony na povrchu kovu podléhají kolektivním oscilacím, když jsou excitovány světlem o specifických vlnových délkách. Tato oscilace je známá jako povrchová plazmonová rezonance (SPR) a způsobuje, že intenzita absorpce a rozptylu stříbrných nanočástic je mnohem vyšší než u stejně velkých neplazmonických nanočástic. Absorpční a rozptylové vlastnosti nanočástic stříbra lze vyladit řízením velikosti a tvaru částic a lokálního indexu lomu v blízkosti jejich povrchu.

Optické vlastnosti sférických nanočástic stříbra jsou vysoce závislé na průměru a stejnoměrnosti nanočástic, které lze pečlivým nastavením výrobních podmínek řídit tak, aby vznikly částice s řízenou velikostí a variačními koeficienty (směrodatná odchylka průměru/průměr) menšími než 15 % (obrázek 1A). Na obrázku 1B jsou zobrazena extinenční  spektra 10 velikostí nanočástic stříbra při identických hmotnostních koncentracích (0,02 mg/ml). Menší nanosféry absorbují především světlo s píky v blízkosti 400 nm, zatímco větší koule vykazují zvýšený rozptyl, širší spektrální píky a intenzitu píků při delších vlnových délkách.

Obrázek 1. A) Transmisní elektronové mikrofotografie (TEM) rovnoměrných nanočástic stříbra o průměru 20 nm, 60 nm a 100 nm. B) Extinenční (součet rozptylu a absorpce) spektra nanočástic stříbra o průměru 10-100 nm při hmotnostní koncentraci 0,02 mg/ml.

Stříbrné nanoplatničky jsou nanočástice ve tvaru destiček s povrchovou plazmonovou rezonancí (SPR) (obrázek 2A), které mají extrémně velký absorpční a rozptylový průřez ve viditelné a blízké infračervené oblasti spektra. Přesným řízením průměru a tloušťky destičky lze vyladit optickou rezonanci nanodestičky tak, aby dosahovala maxima v určitých vlnových délkách (550 nm-950 nm, obrázky 2B a 2C). Nanoplatně mají využití v oblasti povrchově zesíleného Ramanova rozptylu (SERS), fotovoltaiky, molekulární detekce a terapie založené na fototermii.

Obrázek 2. A) Obrázek stříbrných nanoplatniček z transmisního elektronového mikroskopu (TEM). B) Disperze nanoplatniček vykazují barvy, které odrážejí schopnost vyladit plazmonovou rezonanci nanoplatniček ve viditelné a blízké infračervené části spektra (C).

Povrchově zesílená spektroskopie

Další aplikace nanočástic stříbra v biologických aplikacích jsou založeny na využití zesíleného elektromagnetického pole na povrchu a v blízkosti povrchu nanočástice stříbra. Při plazmonové rezonanční vlnové délce fungují nanočástice stříbra jako antény v nanorozměrech a zvyšují intenzitu místního elektromagnetického pole.

Jednou ze spektroskopických technik, která těží ze zesíleného elektromagnetického pole, je Ramanova spektroskopie, při níž lze identifikovat molekuly podle jejich jedinečných vibračních módů. Zatímco vlastní Ramanův rozptyl fotonů z molekul je slabý a k získání Ramanova spektra vyžaduje dlouhou dobu měření, povrchově zesílený Ramanův rozptyl (SERS) z molekul v blízkosti povrchu plazmonických kovových nanočástic nabízí výrazně zesílené Ramanovy signály. Efekt SERS může zesílit Ramanův rozptyl vázaných molekul až o 14 řádů, což umožňuje detekci i jednotlivých molekul.^1,2 Zesílení je způsobeno vysokou intenzitou elektrického pole (neboli "horkými místy"), které se vytváří v místech na povrchu nanočástic a je proto velmi závislé na geometrii nanočástic, povrchových vlastnostech a konkrétní poloze molekuly. Kovové nanočástice vykazující SERS z přidružených molekul (SERS nanotagy) byly použity jako značky v řadě biomedicínských aplikací a platforem, včetně imunoanalýz, detekce sekvencí nukleových kyselin, in vitro celulárního zobrazování, in vivo zobrazování a průtokové cytometrie.

Obrázek 3. A) Organický fluorofor připojený přímo ke kovovému substrátu má obvykle zhasnutou fluorescenci, ale silné povrchově zesílené Ramanovo spektrum (SERS). B) Vzdálení fluoroforu od povrchu kovu vede k povrchově zesílené fluorescenci (SEF).

Zvýšené lokalizované pole přesahuje povrch nanočástice a umístěním fluoroforu do malé vzdálenosti od povrchu stříbrné nanočástice vzniká jev známý jako povrchová fluorescence (SEF). SEF byla poprvé pozorována v 70. letech 20. století a může zvýšit intenzitu emise fluoroforu o řád.³ Zvýšení intenzity fluoroforu lze přičíst dvěma efektům: 1) soustředění přicházejícího světla díky velkému absorpčnímu a rozptylovému průřezu plazmonické částice a 2) snížení doby života fluorescence fluoroforu, které umožňuje návrat excitovaného stavu do základního stavu při vyšší frekvenci.  Tyto dva jevy společně zmírňují dvě nevýhody, které jsou běžné pro organické molekuly barviv: 1) nízký absorpční průřez molekul,  a 2) pomalou dobu cyklu excitace a emise na molekulu. Aby bylo možné maximalizovat zesílení fluorescence fluoroforu, musí být pečlivě navrženy optické vlastnosti kovové nanočástice a geometrie nanotagů SEF přesným řízením velikosti, tvaru a složení kovové částice a rozložení fluoroforu v blízkosti povrchu částice.

Schématické znázornění různých strategií připojení, které jsou nezbytné k dosažení optimálních efektů SERS a SEF s molekulou barviva, je uvedeno na obrázku 3. Připojení molekuly barviva ke kovové nanočástici obvykle vede k zhášení emise v důsledku přenosu energie mezi excitovaným stavem fluoroforu a elektronickými stavy kovu. V tomto případě je Ramanovo spektrum molekuly silně zesíleno v důsledku vysokého elektromagnetického pole na povrchu částice (obrázek 3A). Vzdálení fluoroforu mírně od povrchu částice zabraňuje  zhášení fluorescence a díky vysokému lokálnímu elektromagnetickému  poli vede k velkému zvýšení fotoemise z  molekuly (obrázek 3B).

Antimikrobiální aplikace

Antimikrobiální účinky stříbra lze vysledovat již u Řeků a Římanů, kteří prodloužili pitnost vody tím, že ji uchovávali ve stříbrných nádobách. Ionty stříbra se uvolňují ze stěn nádoby a zajišťují antimikrobiální účinek prostřednictvím interakce iontů stříbra s thiolovými skupinami životně důležitých bakteriálních enzymů a proteinů. To ovlivňuje buněčnou respiraci a transport iontů přes membrány, což vede k buněčné smrti.^4,5 Byly navrženy také další antimikrobiální cesty specifické pro toxicitu nanočástic stříbra. Nanočástice stříbra se mohou ukotvit a následně proniknout do buněčné stěny bakterií, což vede k poškození strukturálních změn v buněčné membráně.⁶ Generování reaktivních forem kyslíku na povrchu nanočástic stříbra může vést k oxidačnímu stresu, který představuje další mechanismus poškození buněk.⁷ Specifická toxicita pro bakterie při zachování nízké toxicity pro člověka vedla k integraci nanočástic stříbra do široké škály výrobků včetně obvazů na rány, obalových materiálů a povrchových nátěrů proti znečištění.

Hlavním mechanismem antimikrobiální aktivity nanočástic stříbra je poskytnutí zdroje stříbrných iontů o vysoké povrchové ploše. Ve vodném prostředí částice oxidují za přítomnosti kyslíku a protonů podle stechiometrické reakce

.

uvolňování iontů Ag+ při rozpouštění povrchu částic. S rostoucí koncentrací stříbrných iontů v roztoku se blíží rovnovážnému stavu a rozpouštění stříbra se zpomaluje. Pokud se však v místním prostředí vyskytují molekuly, které mají ke stříbru afinitu, jako jsou thioly nebo chlor, zůstává koncentrace volných iontů stříbra v roztoku nízká a rozpouštění iontů stříbra z nanočástic stříbra pokračuje. Dlouhodobá antimikrobiální účinnost nanočástic stříbra závisí na udržení účinné koncentrace iontů stříbra v různých roztocích.

Rychlost uvolňování iontů stříbra

Rychlost uvolňování iontů stříbra z nanočástic stříbra závisí na řadě faktorů, včetně velikosti nanočástic, jejich tvaru, obalovacího činidla, stavu agregace a prostředí. Nejmenší velikosti částic mají obvykle nejrychlejší rychlost uvolňování iontů v důsledku vysoké povrchové energie vysoce zakřivených nebo napjatých povrchů nanočástic. K rychlosti uvolňování iontů přispívá také tvar. Obrázek 4 ukazuje profily uvolňování iontů různě velkých sférických nanočástic a stříbrných nanoplateb.

 

Obrázek 4. Uvolňování iontů stříbra v závislosti na čase pro stříbrné kuličky a nanoplatničky různých velikostí. V každém vzorku je použita stejná hmotnost stříbra.

Podle očekávání vykazují menší nanosféry stříbra (průměr 10 nm) výrazně vyšší rychlost uvolňování a konečnou koncentraci iontů než větší nanosféry (průměr 110 nm). Anizotropní stříbrné nanočástice mají výrazně odlišnou rychlost uvolňování iontů než sférické částice. Velké stříbrné nanodestičky s průměrným průměrem 150 nm mají téměř stejný  profil koncentrace stříbra v čase jako sférické částice stříbra o průměru 10 nm a destičky o průměru 35 nm vykazují téměř dvakrát vyšší koncentrace stříbrných iontů než menší stříbrné kuličky.

Funkcionalizace povrchu také hraje roli v rychlosti uvolňování iontů, přičemž pevně vázané uzavírací látky obsahující thiol obecně snižují rychlost uvolňování ve srovnání se snadněji přemístitelnými stabilizačními molekulami, jako je citrát. Agregace částic rovněž snižuje rychlost uvolňování iontů, ale větší vliv agregace má změna kinetiky a distribuce v důsledku usazování. Faktorem, který nejvíce ovlivňuje rychlost uvolňování iontů, je prostředí nanočástic. Zvýšená teplota, přítomnost chloru, thiolů a kyslíku ovlivňují rychlost uvolňování. V některých fyziologických prostředích může dojít k úplnému rozpuštění nanočástic stříbra již za několik hodin.

Pokud pochopíme, jak fyzikální a chemické vlastnosti nanočástic stříbra ovlivňují rychlost uvolňování, můžeme navrhnout kompozity nanomateriálů stříbra tak, abychom dosáhli požadovaného profilu uvolňování iontů. Tato optimalizace je důležitá proto, aby bylo možné minimalizovat množství potřebného stříbra, což povede k nákladově efektivnějšímu výrobku, který bude mít minimální dlouhodobý dopad na životní prostředí.

Značkování a cílení pro biologické zobrazování

Nanočástice stříbra absorbují a rozptylují světlo s mimořádnou účinností  a využívají se při značení a zobrazování. Vysoký rozptylový průřez nanočástic umožňuje zobrazovat jednotlivé nanočástice stříbra  v mikroskopii tmavého pole (obrázek 5) nebo v hyperspektrálních  zobrazovacích systémech.⁸ Připojením biomolekul, jako jsou protilátky nebo peptidy, k povrchu nanočástic stříbra lze nanočástice stříbra zacílit na konkrétní buňky nebo buněčné složky. Připojení  cílových molekul k povrchu může být provedeno prostřednictvím absorpce na  povrchu nanočástic nebo kovalentním spojením nebo fyzisorpcí.  Fyzisorpce se obvykle provádí pomocí nanočástic stříbra se  snadno přemístitelným uzavíracím činidlem, jako je citrát. Úpravou pH  a koncentrace soli lze získat konjugáty stříbrných nanočástic s protilátkami s vysokou  afinitou a nízkým nespecifickým pozadím. Lepšího výkonu lze dosáhnout kovalentním navázáním protilátky na povrch. Jedním z kovalentních přístupů je funkcionalizace nanočástic stříbra  smíšenými monovrstvami thiolovaných molekul PEG, kde část thiolovaného PEG obsahuje funkci karboxylové kyseliny a  zbytek molekul je inertní (methoxy-koncová). Pomocí  ethyl(dimethylaminopropyl) karbodiimidové (EDC) vazby lze pak kovalentně navázat karboxylovou  kyselinu na volné aminy na protilátce,  čímž vznikne zaměřitelná stříbrná nanočástice jako sonda.

Obrázek 5. Mikroskopický snímek stříbrných nanosfér o průměru 60 nm v temném poli.

Nanomedicína a nanobezpečnost

Použití nanočástic stříbra v in vitro a in vivo aplikacích je rychle rostoucí. Kromě ultrajasného fluorescenčního značení na bázi nanočástic stříbra a nanotagů pro povrchovou zesílenou Ramanovu spektroskopii (SERS) patří mezi další aplikace nanočástic stříbra jejich využití jako tepelných zdrojů pro hypertermii a tepelně modulované uvolňování léčiv z povrchových povlaků částic. Nanočástice stříbra mohou být také  začleněny do konstrukcí jádro/plášť. Amorfní obal z oxidu křemičitého rovnoměrně narostlý na jádrech nanočástic stříbra může mít do obalu konjugovány různé funkční skupiny, které poskytují prostředky pro elektrostatické nebo jiné interakce mezi obalem a molekulou. Fluorofory, molekuly léčiv nebo jiné vysokomolekulární organické molekuly mohou být integrovány do obalu pro in vitro nebo in vivo  značení nebo aplikace pro doručování léčiv.

Mnoho budoucích biomedicínských aplikací nanočástic stříbra bude vyžadovat, aby byla dobře pochopena interakce nanočástic s biologickými systémy. Pro aplikace in vivo  je hlavní výzvou navrhnout částice, které mají dlouhou dobu cirkulace a nízkou toxicitu. Experimenty s cílem optimalizovat výkonnost nanočástic v in vivo systémech jsou komplikovány složitostí samotných nanočástic i jejich prostředí. Biologický osud a transport nanočástic je závislý nejen na primárních vlastnostech částic (např. chemismus jádra, velikost, tvar, krystalinita, povrch a stav agregace), ale také na sekundárních vlastnostech, které závisí na interakci nanočástic s cílovými biologickými systémy (např, proteinová korona, rychlost rozpouštění, biodistribuce).⁹ Experimenty prováděné se soubory přesně vyrobených a dobře charakterizovaných nanomateriálů s pouze jednou modifikovanou vlastností (např, chemickým složením jádra, velikostí, tvarem nebo povrchem)  poskytují vhled do biologické odezvy na změněnou vlastnost a  pomáhají určit optimální vlastnosti pro účinný výkon.

Závěry a výhled do budoucna

Jedinečné optické vlastnosti a široce založené antimikrobiální vlastnosti nanočástic stříbra vedly k rychlému nárůstu začleňování nanočástic stříbra do biologických aplikací. Vysoká úroveň kontroly, která je k dispozici pro řízení velikosti, tvaru a povrchu nanočástic stříbra poskytuje mocnou knihovnu nejen pro vytváření funkčních materiálů pro biologické aplikace, ale také pro pochopení základních mechanismů transportu a interakce nanočástic v biologických systémech. Toto poznání spolu s konstrukcí složitějších  multifunkčních nanokompozitů stříbra umožní vytvořit další  generaci sond, zařízení a terapeutik na bázi nanočástic stříbra.

1. Moskovits M. 1978. Surface roughness and the enhanced intensity of Raman scattering by molecules adsorbed on metals. The Journal of Chemical Physics. 69(9):4159-4161. https://doi.org/10.1063/1.437095

2. Kneipp K, Wang Y, Kneipp H, Perelman LT, Itzkan I, Dasari RR, Feld MS. Single Molecule Detection Using Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS). Phys. Rev. Lett.. 78(9):1667-1670. https://doi.org/10.1103/physrevlett.78.1667

3. Geddes CD, Lakowicz JR. 2002. 12(2):121-129. https://doi.org/10.1023/a:1016875709579

4. Rai M, Yadav A, Gade A. 2009. Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials. Biotechnology Advances. 27(1):76-83. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2008.09.002

5. Marambio-Jones C, Hoek EMV. 2010. A review of the antibacterial effects of silver nanomaterials and potential implications for human health and the environment. J Nanopart Res. 12(5):1531-1551. https://doi.org/10.1007/s11051-010-9900-y

6. Sondi I, Salopek-Sondi B. 2004. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria. Journal of Colloid and Interface Science. 275(1):177-182. https://doi.org/10.1016/j.jcis.2004.02.012

7. Kim JS, Kuk E, Yu KN, Kim J, Park SJ, Lee HJ, Kim SH, Park YK, Park YH, Hwang C, et al. 2007. Antimicrobial effects of silver nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 3(1):95-101. https://doi.org/10.1016/j.nano.2006.12.001

8. Carlson C, Hussain SM, Schrand AM, K. Braydich-Stolle L, Hess KL, Jones RL, Schlager JJ. 2008. Unique Cellular Interaction of Silver Nanoparticles: Size-Dependent Generation of Reactive Oxygen Species. J. Phys. Chem. B. 112(43):13608-13619. https://doi.org/10.1021/jp712087m

9. Powers KW, Palazuelos M, Moudgil BM, Roberts SM. 2007. Characterization of the size, shape, and state of dispersion of nanoparticles for toxicological studies. Nanotoxicology. 1(1):42-51. https://doi.org/10.1080/17435390701314902