Nanočástice zlata pro diagnostiku

Alexandra R. Fernandes¹, Pedro V. Baptista¹

¹UCIBIO, Dept. of Life Sciences, FCT-NOVA, Campus Caparica, 2829-516 Caparica

Material Matters™ Publications

[email protected]

Úvod

Výzkum v oblasti nanomedicíny pokročil v mnoha biomedicínských nástrojích a aplikacích nanomateriálů, které se zaměřují především na nové diagnostické platformy a strategie pro terapii. Zatímco první oblastí, která byla v průběhu let důkladněji zkoumána a rozvíjena, bylo podávání léčiv, hlubší pochopení vlastností nanomateriálů umožnilo navrhnout inovativní diagnostické strategie. Jedinečné vlastnosti nanomateriálů spolu s rostoucí schopností přísné kontroly manipulace a sestavování posílily koncept kombinace diagnostiky a doručování do jednoho zařízení jako zásadního přínosu umožňujícího přesnou léčbu. Nanomedicínu tak lze vnímat jako zdokonalení molekulární medicíny, integrující inovace v oblasti genomiky a proteomiky pro personalizovanější medicínu, umožňující přesnou charakterizaci molekulárních profilů pacientů, od včasné diagnostiky až po přesnou terapii, zlepšující výsledky a zároveň minimalizující rizika pro pacienty.^1-2

Tyto nanometrické struktury našly v biomedicíně široké uplatnění, přičemž se zaměřují zejména na diagnostiku, jako je detekce a identifikace metabolitů, proteinů a nukleových kyselin (DNA a RNA). Pravděpodobně nejvýznamnější dopad byl zaznamenán v molekulární diagnostice, kde použití nanomateriálů podnítilo změnu paradigmatu v biodetekci a analytických metodikách. V tomto rámci nabízejí diagnostické techniky založené na nanočásticích nebývalý přínos z hlediska citlivosti. Vzhledem k tomu, že většina biomarkerů se pohybuje v podobném rozmezí velikosti těchto nanostruktur a poskytuje odezvu v poměru 1:1; tento nárůst citlivosti rovněž umožňuje použít menší množství vzorku, čímž se snižuje potřeba robustních přístrojů pro analytické postupy, což vede ke zvýšení přenositelnosti, čímž se koncepční laboratoř dostává do místa potřeby (k lůžku pacienta, do laboratoře lékaře atd.).³

Syntéza a funkcionalizace nanočástic zlata

Většina platforem určených k detekci proteinů se obvykle spoléhá na molekulární rozpoznávání pomocí antigenů a protilátek, zatímco platformy určené k detekci nukleových kyselin se spoléhají na komplementaritu nukleotidových sekvencí prostřednictvím hybridizačních protokolů. V současné době se do biodetekce příslušných biomarkerů nukleotidových sekvencí postupně začleňují systémy založené na nanočásticích, čímž se zvyšuje citlivost a snižují náklady. Mezi nimi se pro vývoj vysoce citlivých biosenzorických platforem používají nanočástice ušlechtilých kovů (NP), zejména zlato, díky svým optickým a fyzikálně-chemickým vlastnostem.³

Klíčovou vlastností AuNPs je jejich lokalizovaná povrchová plazmonová rezonance (LSPR), která je zodpovědná za jejich pozoruhodné optické vlastnosti. LSPR lze definovat jako kolektivní oscilaci elektronů mezi prázdnými orbitaly v reakci na dopadající elektromagnetickou vlnu, která generuje polarizaci v nanočásticích a vyvolává vznik dipolárních momentů. LSPR je velmi závislý na velikosti, tvaru, složení, vzdálenosti mezi nanočásticemi a jejich interakci s okolním dielektrikem. Tento jev je zodpovědný za přisuzování různých barev koloidním suspenzím AuNPs, které se mohou měnit od různých odstínů červené až po modrou a fialovou. Proto je pro vyladění optických vlastností směrem k požadované vlnové délce biodetekce nejdůležitější přísná kontrola velikosti AuNP. K plnému využití těchto optických vlastností lze také použít různé způsoby syntézy, prostředky pro dispergaci v roztoku a strategie pro funkcionalizaci povrchu.^3,4

Nejběžnější a nejjednodušší metodou syntézy AuNPs je chemická redukce soli zlata, obvykle trihydrátu kyseliny tetrachlorové (HAuCl₄^.3H₂O) v přítomnosti redukčních činidel, jako je borohydrid sodný, kyselina askorbová nebo citrát sodný, které se vážou na povrch částic a zajišťují stabilitu, reaktivitu a specifické nábojové vlastnosti. Citrát sodný se například používá od roku 1951 k výrobě monodisperzních nanočástic o velikosti od 1 do 150 nm.⁵ Ačkoli je chemická redukce kovových iontů nejrozšířenější metodou syntézy kovových nanočástic, některá z těchto redukčních činidel jsou toxická, drahá a jejich zbytky mohou být inkorporovány do nanostruktury, což ztěžuje charakterizaci a omezuje in vivo aplikace. Kromě toho je pro získání homogenní velikosti disperze částic rozhodující kontrola procesních proměnných, jako je pH a teplota.⁶ Díky své jednoduchosti a zároveň rozumné kontrole disperze velikosti a tvaru je metoda citrátové redukce navržená Turkevičem a později optimalizovaná Frensem nejrozšířenější metodou výroby AuNPs pro biomedicínské aplikace.^3,5,7,8 Jednoduchou změnou množství redukčního činidla (např, citrátu sodného) přidaného do směsi je možné škálovat výrobu s přiměřenou kontrolou velikosti (obrázek 1). Například při použití nižší koncentrace citrátu sodného je průměr vyrobených částic větší, a tudíž i počet aglomerátů je větší. Ve skutečnosti tento postup přináší lepší výsledky u menších nanočástic (o průměru 10-30 nm), které jsou také stabilnější, a tudíž mají menší tendenci k aglomeraci a poskytují lepší a reprodukovatelnější výsledky v dalším průběhu biodetekce. Stabilita koloidních roztoků AuNPs závisí na jejich interakci s okolním prostředím, a to buď prostřednictvím elektrostatické stabilizace (iontové interakce, při níž se nanočástice vzájemně odpuzují v důsledku přítomnosti nabitých molekul na povrchu), nebo sterické stabilizace zprostředkované kovalentními interakcemi s vhodnými molekulami, které brání přiblížení dalších AuNPs. Kovalentní interakce poskytují některé výhody ve srovnání s iontovými interakcemi, kdy modifikované AuNPs (např, biokonjugáty) vykazují značné zvýšení stability v různých médiích.^6,8

Jedním ze způsobů, jak minimalizovat tendenci AuNPs k aglomeraci, je modifikace povrchu nanočástic pomocí povrchově aktivních látek, polyelektrolytů nebo ligandů. Nejenže se tím zlepší koloidní stabilita, ale také se tím získá možnost derivatizovat AuNPs množstvím biomolekul vhodných pro biorozpoznávání, jako jsou protilátky a oligomery DNA/RNA. Přesto je kvalita procesu funkcionalizace přímo ovlivněna faktory, jako je drsnost substrátu, doba kontaktu s povrchem, koncentrace rozpouštědla a teplota prostředí. Topografie konjugovaných vrstev navíc věrně reprodukuje povrch AuNP, a tedy i jeho povrchové defekty. Jedním z hlavních typů defektů vyskytujících se na povrchu zlata je monoatomická vakance, tj. povrch vykazuje nepravidelnosti, jako je například redukce atomů zlata, což přímo ovlivňuje tvorbu, organizaci a účinnost funkcionalizace.^6,8,9

Obrázek 1. Charakterizace AuNPs syntetizovaných metodou citrátové redukce. Pro charakterizaci AuNPs bylo použito několik standardních a jednoduchých technik, jako je A) transmisní elektronová mikroskopie (TEM), která ukazuje sférický tvar s dobrou disperzí velikosti; B) UV-viditelná spektroskopie, kde se pro posouzení velikosti a stability používá pík LSPR; C) dynamický rozptyl světla (DLS), který měří hydrodynamické poloměry AuNPs, čímž zdůrazňuje disperzi velikosti; a D) zeta potenciál, který poskytuje informaci o povrchovém náboji AuNPs, a tedy posouzení stability. Celkově lze tyto údaje snadno získat a poskytují dostatek informací pro výrobní charakterizaci.

Obvykle se pro povrchovou funkcionalizaci AuNP používají tzv. alkanethioly pro chemickou stabilitu a snadnou tvorbu samoorganizujících se monovrstev. Lze také použít několik stabilizačních činidel a polymerních sloučenin, jako je citrát sodný, cetrimoniumbromid (CTAB), polyethylenglykol (PEG), oxid křemičitý a další.^6,8 Volba stabilizačního činidla je rozhodující pro diagnostické aplikace; toto rozhraní se často používá jako linker pro biorozpoznávací prvek (např, DNA, RNA, aptamer, peptidy, protilátky), který by neměl narušit vnitřní vlastnost nanorozměru využívanou pro přenos signálu při rozpoznání cílového analytu. Tato stabilizace AuNPs může být také řízena pomocí multifunkčních polymerů se schopností vázat se na povrch zlata a zajišťovat současné přihlášení k rozpoznávacímu prvku (např. methylové, aminové, karboxylové, karbonylové, hydroxylové, a dokonce sulfhydrylové skupiny). Snad nejpoužívanějšími linkery jsou ty, které spoléhají na (alespoň) jednu thiol-reaktivní skupinu, která se silně a spontánně váže na zlato díky silné interakci mezi atomy zlata a síry. Ve skutečnosti se jedná o preferovanou strategii pro přímé navázání DNA, RNA a aptamerových oligomerů na povrch AuNPs, jak se ukázalo v rozmanitých konceptech molekulární diagnostiky.^10,11

Antilátky jsou glykoproteiny patřící do třídy imunoglobulinů běžně spojovaných s obranou organismů proti cizorodým antigenům. Protilátky se mohou vázat na různé povrchy a byly použity jako biorozpoznávací molekuly pro biodetekci, zejména ve spojení s AuNPs. Protilátky mají vysoký stupeň afinity a specifičnosti se schopností detekovat, rozpoznat a navázat se na cílový antigen.¹² Princip asociace mezi epitopem antigenu a jeho protilátkou zahrnuje komplementaritu mezi nimi a reverzibilní vazbu prostřednictvím elektrostatických interakcí, vodíkových vazeb, hydrofobních a van der Waalsových interakcí. Jelikož přímá funkcionalizace protilátek na povrch AuNPs není tak jednoduchá jako u DNA/RNA, použití heterofunkčních polymerů, jako je PEG (HS-PEG-NH₂), poskytuje cestu k funkcionalizaci nanočástic, kde existuje kovalentní vazba prostřednictvím skupiny -SH, zatímco skupina NH₂ je k dispozici pro vazbu protilátky prostřednictvím volných COO- skupin. Funkcionalizace se obvykle dosahuje předchozí aktivací jedné z mnoha COOH skupin protilátky pomocí spojovacích činidel, jako je 1-ethyl-(3-dimethylaminopropyl)-karbodiimid (EDC).¹⁰

AuNPs pro molekulární diagnostiku

Bylo navrženo několik kolorimetrických přístupů založených na AuNPs pro detekci biomolekul (např, nukleových kyselin a proteinů) s vysokou úrovní citlivosti a specifičnosti.^3,13 Většina těchto metod se spoléhá na kolorimetrickou změnu roztoku AuNPs při agregaci, což je proces, který může být zprostředkován buď změnami dielektrika média, nebo interakcí s určeným cílem. V prvním případě vazba a adsorpce terče moduluje účinek změn dielektrika média na AuNPs; druhý způsob spoléhá na schopnost terče zprostředkovat interakce mezi částicemi, a to buď podporou zesíťování AuNPs, nebo jejich udržováním od sebe prostřednictvím sterických překážek. Výsledná agregace vede k posunu pásu LSPR, který lze vnímat pouhým okem nebo měřit pomocí standardní spektrofotometrie. To je případ několika hybridizačních protokolů, kdy jsou ssDNA sondy funkcionalizovány na AuNPs a použity k identifikaci DNA/RNA cílů v závislosti na sekvenci (obrázek 2).¹⁰

Obrázek 2. Nanočástice zlata (AuNPs) pro molekulární diagnostiku. AuNPs lze použít v mnoha diagnostických schématech založených na rozpoznávání protilátek a antigenů nebo hybridizaci DNA, jako jsou kolorimetrické testy založené na vzdálenosti mezi částicemi, modulace fluorescence v závislosti na vzdálenosti mezi fluoroforem a povrchem AuNP, povrchově zesílená Ramanova spektroskopie (SERS) a použití AuNPs jako značek v platformách pro laterální průtok (LFA) v místě potřeby.

Plasmonické specifické a ostré elektrické posuny AuNPs lze také využít k detekci biomarkeru na základě rozptylu světla. Tyto přístupy se opírají o intenzivní rozptyl větších a anizotropních AuNPs, jejichž spektrální změny jsou spojeny s vazbou nebo asociací s molekulami.¹⁴

AuNPs jsou také užitečné pro elektrochemickou detekci, konkrétně pro vazbu enzymů na elektrody a zprostředkování elektrochemických reakcí jako redoxní katalyzátory.¹⁵ Kromě toho jsou AuNPs známými zhášeči fluorescenčních barviv, která jsou umístěna v blízkosti jejich povrchu, což je vlastnost, která byla široce využívána pro schémata molekulární detekce. V těchto platformách vazba na specifický cíl vyvolává konformační změnu rozpoznávací části, která fluorofor posune dále od AuNP nebo blíže k povrchu, čímž se zvýší nebo sníží emise fluorescence.¹⁶

Z využití AuNPs, zejména anizotropních struktur a struktur nepravidelného tvaru, profituje také ramanská spektroskopie. Povrchově zesílená Ramanova spektroskopie (SERS) výrazně zvyšuje asociaci kovového povrchu s vnitřně slabou intenzitou Ramanova signálu biomarkerů. Například nesférické AuNPs, kde okraje nanočástic působí jako horký bod pro až 10¹² až 10¹⁴ zesílení signálu SERS, nabízejí nový rozměr multiplexní detekce biomarkerů.¹⁷

Případ pro zařízení s bočním průtokem

Zařízení s bočním průtokem (LFA) jsou přenosná zařízení schopná přenášet biologické tekutiny, jako je krev nebo sérum, prostřednictvím jejich kapilárního působení, aniž by vyžadovala externí napájení. Zařízení LFA jsou rychlá a jednoduchá na manipulaci, levná, s přijatelnou specifičností bez nutnosti chlazení. Několik diagnostik zahrnuje především AuNPs jako značky/značky pro sondy, což zvyšuje citlivost systému. Nejznámějším imunoanalýzou LFA je těhotenský test, cílem však může být jakákoli molekula a existují již rychlé testy mimo jiné na SARS-CoV-2, HIV, HCV.^3,18,19 Principem mechanismu LFA je kapilární migrace biomarkerů ve vzorku směrem k oblasti, kde je k AuNPs konjugován první rozpoznávací prvek, typicky záchytná ssDNA oligomerní sonda nebo antigen/protilátka. Poté tento komplex migruje do detekční oblasti přes hydrofobní nitrocelulózovou membránu nebo acetát celulózy a je imobilizován druhým rozpoznávacím/chytacím prvkem. V kontrolní části zařízení druhý záchytný/rozpoznávací prvek imobilizuje počáteční komplex, ale nikoliv komplex, který je předmětem zájmu, čímž se získá výsledek. Výrazná zářivě červená barva AuNPs je činí ideálními značkami pro tyto systémy, což je činí vhodnými pro hodnocení pouhým okem.³

Pravidla a normy

Rostoucí počet koncepčních zařízení a platforem pro diagnostiku in vitro s využitím nanomateriálů a AuNPs vyvolal potřebu vytvořit standardizované metodiky a regulační protokoly pro výrobu a charakterizaci nanomateriálů.²⁰ Schopnost celosvětových regulačních orgánů regulovat tyto výrobky je však omezena samotnou povahou a rozsahem nanomateriálů. Jedno z takových regulačních úsilí bylo podniknuto v Laboratoři pro charakterizaci nanotechnologií (NCL), která je formální vědeckou interakcí tří federálních agentur USA: National Cancer Institute (NCI), Food and Drug Administration (FDA) a National Institute of Standards and Technology (NIST), která byla vytvořena na podporu rostoucí potřeby charakterizace a standardizace. Navrhované pokyny a protokoly zahrnují fyzikálně-chemickou charakterizaci (tj. velikost, morfologii, tvar, povrchový náboj atd.), in vitro charakterizaci (tj. sterilitu, uvolňování léčiv, cílení, toxicitu atd.) a in vivo charakterizaci (tj, účinnost, expozice atd.).

Mezinárodní organizace pro normalizaci (ISO) již zavedla některé pokyny a certifikace, například ISO/TS 12901: 2012 pro řízení rizik aplikovaných na nanomateriálové inženýrství; ISO/TR 11360: 2010 pro klasifikaci nanomateriálů, ISO/TS 12025: 2012 pro kvantifikaci NOAA generovaných aerosoly a ISO/TS 16195: 2013 s pokyny pro zkoušky materiálů obsahujících části v nanorozměrech. Všechny pokyny a certifikace musí být v souladu s obecnější směrnicí upravující výrobu a komercializaci diagnostik in vitro (IVD) (směrnice Evropského parlamentu a Rady 98/79/ES ze dne 27. října 1998 o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro). Navzdory těmto snahám o standardizaci je odhadovaná doba uvedení molekulárních diagnostických systémů obsahujících nanočástice a nanomateriály na trh stále značně dlouhá.

Přísliby a výzvy

Přes významný pokrok v používání AuNPs pro molekulární diagnostiku zbývá ještě mnoho prozkoumat, včetně zlepšení robustnosti a reprodukovatelnosti navrhovaných systémů. Pravděpodobně největší výzvou je rozšíření výroby nejinovativnějších konceptů a jejich převedení do klinického použití. Několik obav týkajících se kontroly a charakterizace každé vyrobené šarže nanočástic a následné funkcionalizace je třeba pečlivě vyhodnotit podle stávajících regulačních směrnic a vyžadují vhodné metody pro požadovanou kontrolu kvality. Aby se všechny tyto inovativní systémy založené na AuNPs dostaly na trh diagnostiky in vitro, musí dodržovat nově vznikající normy a předpisy spojené se stávajícími certifikáty a průvodci ISO, které ovlivní a změní způsob provádění diagnostiky.

Poděkování

Autoři děkují FCT/MCTES za finanční podporu UCIBIO (UIDB/04378/2020). Děkujeme také Catarině Roma-Rodrigues za grafickou podporu.

Navštivte archiv našich publikací Material Matters™

Materiály

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

Odkazy

1. Paunovska K, Loughrey D, Sago CD, Langer R, Dahlman JE. 2019. Using Large Datasets to Understand Nanotechnology. Adv. Mater.. 31(43):1902798. https://doi.org/10.1002/adma.201902798

2. Greish K, Mathur A, Bakhiet M, Taurin S. 2018. Nanomedicine: is it lost in translation?. Therapeutic Delivery. 9(4):269-285. https://doi.org/10.4155/tde-2017-0118

3. Cordeiro M, Ferreira Carlos F, Pedrosa P, Lopez A, Baptista P. 2016. Gold Nanoparticles for Diagnostics: Advances towards Points of Care. Diagnostics. 6(4):43. https://doi.org/10.3390/diagnostics6040043

4. Herizchi R, Abbasi E, Milani M, Akbarzadeh A. 2016. Current methods for synthesis of gold nanoparticles. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44(2):596-602. https://doi.org/10.3109/21691401.2014.971807

5. Turkevich J, Stevenson PC, Hillier J. 1951. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday Soc.. 1155. https://doi.org/10.1039/df9511100055

6. Carnovale C, Bryant G, Shukla R, Bansal V. 2016. Size, shape and surface chemistry of nano-gold dictate its cellular interactions, uptake and toxicity. Progress in Materials Science. 83152-190. https://doi.org/10.1016/j.pmatsci.2016.04.003

7. FRENS G. 1973. Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions. Nature Physical Science. 241(105):20-22. https://doi.org/10.1038/physci241020a0

8. Hu X, Zhang Y, Ding T, Liu J, Zhao H. 2020. Multifunctional Gold Nanoparticles: A Novel Nanomaterial for Various Medical Applications and Biological Activities. Front. Bioeng. Biotechnol.. 8 https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.00990

9. Love JC, Estroff LA, Kriebel JK, Nuzzo RG, Whitesides GM. 2005. Self-Assembled Monolayers of Thiolates on Metals as a Form of Nanotechnology. Chem. Rev.. 105(4):1103-1170. https://doi.org/10.1021/cr0300789

10. Conde J, Dias JT, Grazu V, Moros M, Baptista PV, de la Fuente JM. 2014. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Front. Chem.. 2 https://doi.org/10.3389/fchem.2014.00048

11. Graczyk A, Pawlowska R, Jedrzejczyk D, Chworos A. 2020. Gold Nanoparticles in Conjunction with Nucleic Acids as a Modern Molecular System for Cellular Delivery. Molecules. 25(1):204. https://doi.org/10.3390/molecules25010204

12. Morales MA, Halpern JM. 2018. Guide to Selecting a Biorecognition Element for Biosensors. Bioconjugate Chem.. 29(10):3231-3239. https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.8b00592

13. Chang C, Chen C, Wu T, Yang C, Lin C, Chen C. 2019. Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Strategies for Chemical and Biological Sensing Applications. Nanomaterials. 9(6):861. https://doi.org/10.3390/nano9060861

14. Yang C, Xu Y, Pourhassan-Moghaddam M, Tran D, Wu L, Zhou X, Thierry B. 2019. Surface Plasmon Enhanced Light Scattering Biosensing: Size Dependence on the Gold Nanoparticle Tag. Sensors. 19(2):323. https://doi.org/10.3390/s19020323

15. Rasheed PA, Sandhyarani N. 2017. Electrochemical DNA sensors based on the use of gold nanoparticles: a review on recent developments. Microchim Acta. 184(4):981-1000. https://doi.org/10.1007/s00604-017-2143-1

16. Bouché M, Hsu JC, Dong YC, Kim J, Taing K, Cormode DP. 2020. Recent Advances in Molecular Imaging with Gold Nanoparticles. Bioconjugate Chem.. 31(2):303-314. https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.9b00669

17. Kasera S, Herrmann LO, Barrio Jd, Baumberg JJ, Scherman OA. 2015. Quantitative multiplexing with nano-self-assemblies in SERS. Sci Rep. 4(1): https://doi.org/10.1038/srep06785

18. Huang C, Wen T, Shi F, Zeng X, Jiao Y. 2020. Rapid Detection of IgM Antibodies against the SARS-CoV-2 Virus via Colloidal Gold Nanoparticle-Based Lateral-Flow Assay. ACS Omega. 5(21):12550-12556. https://doi.org/10.1021/acsomega.0c01554

19. Kim H, Chung D, Kang M. 2019. A new point-of-care test for the diagnosis of infectious diseases based on multiplex lateral flow immunoassays. Analyst. 144(8):2460-2466. https://doi.org/10.1039/c8an02295j

20. Baer DR. 2012. Application of surface analysis methods to nanomaterials: summary of ISO/TC 201 technical report: ISO 14187:2011 - surface chemical analysis - characterization of nanomaterials. Surf. Interface Anal.. 44(9):1305-1308. https://doi.org/10.1002/sia.4938