Fluorescenční nanodiamantové částice: Vlastnosti a aplikace

Dr. Olga A. Shenderova

President, Adámas Nanotechnologies, Inc.

Úvod

Částice nanodiamantu (ND) se stále častěji využívají jako diagnostické, zobrazovací a terapeutické látky v biomedicíně,¹ pro kryptografii a kvantové výpočty při zpracování kvantové informace a jako jednospinové senzory v nanomagnetometrii.^2,3 Většina těchto aplikací je založena na jedinečných optických a magnetických vlastnostech spojených s bodovými defekty v diamantu. Díky přítomnosti širokého pásmového úseku NS často obsahují atomové defekty nebo nečistoty, z nichž některé jsou vysoce luminiscenční, což je činí užitečnými jako fluorescenční, katodoluminiscenční nebo fotoakustické zobrazovací prostředky.¹ NS jsou vysoce biokompatibilní a mají přirozeně nízkou cytotoxicitu a genotoxicitu.¹

Přečtěte si více o

• Optické vlastnosti fluorescenčního nanodiamantu (FND)
• Nanodiamond Surface Chemistry
• Aplikace
• Reference

Optické vlastnosti fluorescenčního nanodiamantu (FND)

Dusík je nejběžnější příměsí v diamantu, která je do krystalové mřížky začleněna jako izolované substituční atomy dusíku nebo dva nejbližší sousední substituční atomy dusíku, kromě dalších četných defektů obsahujících N. Vakance zachycené atomy dusíku tvoří různá barevná centra v závislosti na typu stavu N v diamantu. Opticky aktivními defekty, kterým se věnuje největší pozornost, jsou defekt dusík-vakance (N-V), který je zodpovědný za červenou/blízkou infračervenou fluorescenci diamantu, a barevná centra dusík-vakance-dusík (N-V-N) (nebo H3 centra) s jasně zelenou fotoluminiscencí (obrázek 1).^1-3 N-V centrum je defekt tvořený v diamantu jedním substitučním atomem dusíku a přilehlou vakancí, zatímco N-V-N centrum se skládá z komplexu dusík-vakance-dusík (obrázek 2). Vakance mohou vznikat ozařováním ND částicemi s vysokou energií. Následné žíhání při vysoké teplotě způsobí difúzi vakancí a vznik barevných center s atomy dusíku.

Obrázek 1. Fluorescence diamantu je založena na barevných centrech zabudovaných do diamantové mřížky: dusíková vakanční centra (N-V) poskytují červenou fluorescenci (vlevo) a N-V-N (nebo H3 centrum) vyzařují zelené světlo (vpravo).

Obrázek 2. Fotoluminiscenční emisní spektra 100nm ND částic obsahujících N-V centra (a) a N-V-N centra (b) dispergovaných v DI vodě o koncentraci 1 mg/ml. Excitační vlnová délka je 532 nm a 442 nm. Pík při 488nm (b) odpovídá Ramanovu posunu diamantu.

Optické vlastnosti N-V centra jsou vhodné pro aplikace biologického zobrazování, s optickou excitací v rozmezí 490-560 nm a emisí v červené a blízké infračervené oblasti (637-800 nm) (obrázek 2a), mimo dosah většiny autofluoreskujících buněčných komponent. K emisi dochází ve spektrálním okně s nízkou absorpcí, které je atraktivní pro biologické značení díky většímu průniku světla do okolní tkáně. Spektra N-V center vykazují nulovou fononovou čáru (ZPL) při 638 nm pro záporně nabitý defekt (N-V^-) a ZPL při 575 nm pro neutrální stav (obrázek 2a). Intenzita luminiscence z ND obsahujících NV centra závisí na počtu N-V center v částici. Například 100nm ND mohou mít jas PL převyšující jas barviva Atto 532 o více než řád, pokud se porovnají vedle sebe za stejných podmínek pomocí fluorescenční mikroskopie s totálním vnitřním odrazem  měření. Centrum H3 vyzařuje zelenou fluorescenci s maximem kolem 530 nm (obrázek 2b) při excitaci modrým světlem. Pozoruhodnou vlastností N-V a N-V-N center je, že nefotobleasují ani neblikájí ani za podmínek nepřetržité excitace vysokou energií⁴ čímž předčí konvenční chromofory díky své nebývalé fotostabilitě.

Záporně nabité NV centrum v ND částicích se také ukázalo jako důležitý systém pro kvantové snímání.^2,3 Protože spinový stav N-V^- centra lze opticky detekovat ve spojení s protokolem magnetické rezonance pomocí opticky detekované magnetické rezonance (ODMR) a stav spinu je citlivý na okolní magnetické pole, může být ND částice obsahující jediný N-V- centrum opticky detekována.sup>- centrum lze použít jako ultrasenzitivní magnetometr pracující za okolních podmínek. Kromě magnetického pole vykazují N-V^- centra vysokou citlivost na elektrické pole, teplotu a deformaci.^2,3

Nanodiamond Surface Chemistry

Jelikož jsou barevná centra zabudována v diamantové matrici, jejich fluorescenční vlastnosti nejsou ovlivněny modifikací povrchu.¹ Ačkoli povrch objemového diamantu byl považován za chemicky inertní, ND obvykle obsahují četné povrchové funkční skupiny obsahující kyslík (tj, -COOH, -OH, karbonyly, estery atd.), které se zavádějí při čištění pomocí silných oxidačních činidel nebo vznikají redukční reakcí (např. pomocí hydridu lithia a hliníku, LiAlH4).⁵ ND lze také čistit pomocí leptání sp² uhlíku vodíkem. Snadná funkcionalizace povrchu byla provedena chemickými, fotochemickými, mechanochemickými, enzymatickými, plazmovými a laserem asistovanými metodami.⁵ Použití silných chemických úprav nebo extrémních teplot (tj, autoklávování pro sterilizaci nebo kapalný dusík pro skladování) činí ND vhodnými pro lékařské použití, aniž by došlo k degradaci krystalické struktury (sp³ vazby) jádra. Díky více způsobům povrchové funkcionalizace lze ND snadno začlenit do jiných matric, které jsou užitečné pro vazbu biologických entit, jako jsou proteiny, enzymy, hormony, antigeny, DNA nebo léčiva, a to jak prostřednictvím elektrostatických, tak kovalentních interakcí.⁶ Například zapouzdření fluorescenčních ND do lipidové vrstvy zvyšuje difúzi částic v cytoplazmě o více než jeden řád.⁷ Povrch ND lze derivatizovat různými organickými funkčními skupinami pro následnou vazbu s biologicky aktivními molekulami, což je vhodné pro diagnostické a terapeutické aplikace. Vysoká specifita cílení FND v různých buněčných testech byla prokázána u FND kovalentně konjugovaných se streptavidinem, na který byly navázány zájmové protilátky značené biotinem.⁸ Aby se zabránilo nespecifickému značení, doporučuje se použít jako stabilizační činidlo hovězí sérový albumin (BSA), který zajišťuje vysokou odolnost diamantových nanočástic potažených BSA proti flokulaci ve fosfátovém pufrovaném roztoku.⁹

Použití

První hlášené použití FND pro in vitro. biologické značení se objevilo v roce 2005,¹⁰ přičemž se ukázalo, že FND obsahující N-V centra mohou být spontánně internalizovány buňkami a mají velmi nízkou toxicitu. Jas a stabilita fluorescence těchto diamantů je učinily vhodnými pro sledování jednotlivých částic v buňkách.⁴ Stabilní fluorescence diamantů umožňuje dlouhodobé optické sledování a snímání v nanorozměrech. Lepšího kontrastu obrazu ND v buňkách lze také dosáhnout pomocí časově řízené detekce fluorescence N-V centra¹¹ s využitím dlouhé doby života fluorescence, až ~20 ns, ND, která je podstatně delší než doba života, ~3 ns, pro autofluorescenci buněk a tkání.

Dokonalá fotostabilita FND umožnila superrozlišovací zobrazování pomocí stimulované deplece emise (STED).⁹   Trojrozměrného zobrazování s vysokým rozlišením lze snadno dosáhnout v reálném čase.  Pomocí mikroskopie STED byly v buňkách rozlišeny jednotlivé částice FND (~30 nm) se subdifrakčním rozlišením přibližně 40 nm.⁹

Multifotonové zobrazování s excitací je výkonný nástroj, který umožňuje zobrazování tkání v živých organismech s větší hloubkou průniku. Excituje fluorofor v ohnisku, čímž snižuje autofluorescenci buněk.  Kromě toho mikroskopie poskytuje lepší kontrast obrazu a menší fotopoškození buněk. Přítomnost jednotlivých částic FND (~40 nm) v buňkách byla detekována pomocí femtosekundového infračerveného laseru.⁷

Pro zlepšení kontrastu obrazu FND byla využita spinová vlastnost N-V^- center, opticky detekovaná magnetická rezonance .nbsp;in vitro a in vivo a překonání problému autofluorescence způsobené endogenními molekulami.^12,13 Při zobrazování fluorescence v širokém poli in vivo střídavým mikrovlnným zářením se modulovala pouze intenzita fluorescence N-V^- centra, zatímco fluorescence pozadí zůstávala konstantní. Zpracování obrazu účinně odstranilo signály autofluorescence pozadí a výrazně zlepšilo kontrast obrazu.¹² V alternativním přístupu bylo použito modulované magnetické pole k dosažení širokoúhlého zobrazení N-V^- center bez pozadí v ND umístěných v sentinelové lymfatické uzlině.¹⁴ Kontrast obrazu byl zlepšen téměř o dva řády. Některá barevná centra v NDs mají katodoluminiscenci a zůstávají stabilní při dlouhodobém působení elektronového svazku, což poskytuje cenné značky pro biozobrazování založené na korelační světelné a elektronové mikroskopii (CLEM). Barevné obrazy zelených a červených FND v živých buňkách HeLa byly získány pomocí mikroskopu CLEM¹⁵ odhalujícího strukturální detaily s vynikajícím prostorovým rozlišením v živých biologických systémech. To ukazuje, že mohou zvýšit citlivost klinické diagnostiky.

Shrnem lze říci, že NDs obsahující barevná centra mají jasnou fluorescenci bez fotobleachingu a blikání, což v kombinaci s jejich biokompatibilitou a snadnou biofunkcionalizací činí z NDs ideální biosondy pro molekulární zobrazování a značení buněk. Jedinečná kombinace spinových a fotoluminiscenčních vlastností určitých typů barevných center v ND otevírá nové jasné perspektivy při objevování nových metod biologického zobrazování a snímání založených na barevných centrech ND.

Odkazy

1. Vaijayanthimala V, Lee DK, Kim SV, Yen A, Tsai N, Ho D, Chang H, Shenderova O. 2015. Nanodiamond-mediated drug delivery and imaging: challenges and opportunities. Expert Opinion on Drug Delivery. 12(5):735-749. https://doi.org/10.1517/17425247.2015.992412

2. Schirhagl R, Chang K, Loretz M, Degen CL. 2014. Nitrogen-Vacancy Centers in Diamond: Nanoscale Sensors for Physics and Biology. Annu. Rev. Phys. Chem.. 65(1):83-105. https://doi.org/10.1146/annurev-physchem-040513-103659

3. Doherty MW, Manson NB, Delaney P, Jelezko F, Wrachtrup J, Hollenberg LC. 2013. The nitrogen-vacancy colour centre in diamond. Physics Reports. 528(1):1-45. https://doi.org/10.1016/j.physrep.2013.02.001

4. Chang Y, Lee H, Chen K, Chang C, Tsai D, Fu C, Lim T, Tzeng Y, Fang C, Han C, et al. 2008. Mass production and dynamic imaging of fluorescent nanodiamonds. Nature Nanotech. 3(5):284-288. https://doi.org/10.1038/nnano.2008.99

5. Mochalin VN, Shenderova O, Ho D, Gogotsi Y. 2012. The properties and applications of nanodiamonds. Nature Nanotech. 7(1):11-23. https://doi.org/10.1038/nnano.2011.209

6. Krueger A, Lang D. 2012. Functionality is Key: Recent Progress in the Surface Modification of Nanodiamond. Adv. Funct. Mater.. 22(5):890-906. https://doi.org/10.1002/adfm.201102670

7. Hui YY, Zhang B, Chang Y, Chang C, Chang H, Hsu J, Chang K, Chang F. 2010. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy of lipid-encapsulated fluorescent nanodiamonds in living cells. Opt. Express. 18(6):5896. https://doi.org/10.1364/oe.18.005896

8. Chang B, Lin H, Su L, Lin W, Lin R, Tzeng Y, Lee RT, Lee YC, Yu AL, Chang H. 2013. Highly Fluorescent Nanodiamonds Protein-Functionalized for Cell Labeling and Targeting. Adv. Funct. Mater.. 23(46):5737-5745. https://doi.org/10.1002/adfm.201301075

9. Tzeng Y, Faklaris O, Chang B, Kuo Y, Hsu J, Chang H. 2011. Superresolution Imaging of Albumin-Conjugated Fluorescent Nanodiamonds in Cells by Stimulated Emission Depletion. Angew. Chem. Int. Ed.. 50(10):2262-2265. https://doi.org/10.1002/anie.201007215

10. Yu S, Kang M, Chang H, Chen K, Yu Y. 2005. Bright Fluorescent Nanodiamonds:  No Photobleaching and Low Cytotoxicity. J. Am. Chem. Soc.. 127(50):17604-17605. https://doi.org/10.1021/ja0567081

11. Kuo Y, Hsu T, Wu Y, Hsu J, Chang H. 2013. Fluorescence lifetime imaging microscopy of nanodiamonds in vivo. https://doi.org/10.1117/12.2004494

12. Igarashi R, Yoshinari Y, Yokota H, Sugi T, Sugihara F, Ikeda K, Sumiya H, Tsuji S, Mori I, Tochio H, et al. 2012. Real-Time Background-Free Selective Imaging of Fluorescent Nanodiamonds in Vivo. Nano Lett.. 12(11):5726-5732. https://doi.org/10.1021/nl302979d

13. Hegyi A, Yablonovitch E. 2013. Molecular Imaging by Optically Detected Electron Spin Resonance of Nitrogen-Vacancies in Nanodiamonds. Nano Lett.. 13(3):1173-1178. https://doi.org/10.1021/nl304570b

14. Sarkar SK, Bumb A, Wu X, Sochacki KA, Kellman P, Brechbiel MW, Neuman KC. 2014. Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence. Biomed. Opt. Express. 5(4):1190. https://doi.org/10.1364/boe.5.001190

15. Nawa Y, Inami W, Lin S, Kawata Y, Terakawa S, Fang C, Chang H. 2014. Multi-Color Imaging of Fluorescent Nanodiamonds in Living HeLa Cells Using Direct Electron-Beam Excitation. ChemPhysChem. 15(4):721-726. https://doi.org/10.1002/cphc.201300802