Hmotnostní spektrometrie

Co je to hmotnostní spektrometrie a k čemu se používá?

Hmotnostní spektrometrie (MS) je analytický nástroj, který se používá ke stanovení hmotností různých sloučenin ve vzorku. Tato technika je užitečná pro identifikaci a kvantifikaci sloučenin ve směsi, což může zahrnovat detekci nečistot ve vzorku nebo stanovení směsi proteinů ve vzorku buněk. Funguje na základě měření poměru m/z   (hmotnost-náboj) iontů.

Jak funguje hmotnostní spektrometrie?

Existuje mnoho variací na téma hmotnostní spektrometrie, ale základy jsou stejné a jsou přibližně tři (může záležet na tom, jak si raději "seskupíte" kroky) a jsou následující:

1. Ionizace (zdroj iontů)
2. Separace/izolace iontů (hmotnostní analyzátor)
3. Detekce (detektor iontů)

Poznámka: Celý proces by měl probíhat ve vakuu.

1. Ionizace: Vzorek se odpaří a ionizuje. (Poznámka: Pokud nelze vzorek odpařit, aniž by se rozložil, nelze jej analyzovat hmotnostním spektrometrem.) Raná spektrometrie organických sloučenin se spoléhala na elektronový paprsek, který by rozbil bílkoviny. Ionizace elektrosprejem (ESI) a ionizace laserovou desorpcí s asistencí matrice (MALDI) mohou ionizovat biomolekuly, aniž by je zničily. Každá z ionizačních technik (ESI nebo MALDI) má své výhody a nevýhody.

Ionty analytu se označují jako "molekulární ionty" (pokud nejsou fragmentovány). Hmotnostní spektrometrie měří pouze hmotnost nabitých částic (tj. iontů). Neutrální sloučeniny jsou fakticky neviditelné, ale kationty (kladně nabité) a anionty (záporně nabité) jsou "vidět" (i když některé typy hmotnostní spektrometrie zahrnují vyřazení aniontů). V závislosti na typu hmotnostní spektrometrie mají ionty různé množství náboje. Například u MALDI jsou výsledkem jednotlivé náboje, ale u ESI velkých molekul budou náboje větší.

2. Separace/izolace iontů: V této fázi se ionty oddělují podle hodnot m/z pomocí elektrických a/nebo magnetických polí. Mohou se používat různé typy hmotnostních analyzátorů, ale podstata je stejná: interakce mezi různě nabitými a různě velkými molekulami a polem (poli) způsobí oddělení iontů na základě m/z. U separace pomocí elektrického pole je důležitá doba letu (TOF). Velikost a náboj iontu určují, jak rychle ion dosáhne detektoru. (Například v elektrickém poli se silněji nabitý malý ion bude pohybovat rychleji než méně nabitý větší ion (obrázek 1). Při separaci v magnetickém poli budou různé ionty různě obloukovitě dopadat na detektor a dopadat na různá místa, opět v závislosti na velikosti a náboji. Jinými slovy, u elektrických polí záleží na tom, kdy je iont detekován, ale u magnetických polí záleží na tom, kde je iont detekován.

3. Detekce: Ionty separované hmotnostním analyzátorem dopadají na detektor iontů, který na počítači zaznamenává, kolik iontů dopadlo pro každý konkrétní poměr m/z. V případě, že iont dopadne na detektor, je to pro něj důležité. Výstupem je zpravidla svislý sloupcový graf, jehož osa x představuje rostoucí m/z a osa y relativní množství.

Obrázek 1. Schéma pro MALDI-TOF MS (hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí/ionizací v čase letu s asistovanou matricí)

Obrázek 2. Schéma pro ESI-MS (hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem).

Jak číst spektrum hmotnostní spektrometrie

Osa y grafu představuje relativní intenzitu nebo množství. Základním píkem je pík/sloupec s největší relativní abundancí. Základní pík může, ale nemusí být molekulový ion. (Dnešní hmotnostní spektrometry mohou snadno rozlišit ionty lišící se o jeden amu, například ionty využívající atom deuteria místo atomu vodíku.) Každý pík na grafu bude odpovídat jinému m/z a intenzitě. Pokud mají ionty jediný náboj, bude hodnota m/z odpovídat molekulové hmotnosti. Obvykle pík s nejvyšším m/z odpovídá molekulárnímu iontu, který udává relativní molekulovou hmotnost sloučeniny. (Může se jednat o fragmenty, ale obvykle se nejedná o větší sloučeniny.) Souhrnně vzatý vzorec spektra - fragmenty a molekulární ion - může určit, o jaký vzorek se jedná. Pro porovnání spekter a identifikaci vzorku je užitečná databáze grafů hmotnostních spekter. Jednu takovou databázi má NIST 

.

Obrázek 3. Laserová desorpce/ionizace s asistencí matrice

Toto konkrétní spektrum je příkladem hmotnostní spektrometrie s asistovanou laserovou desorpcí/ionizací s matricí (MALDI). Jedná se o pozitivní iontovou MALDI MS neutrálních N-vázaných glykanů z ovalbuminu uvolněných působením PNGázy F a zaznamenaných s použitím 2,5-DHB jako matrice. Písmena (A-L) označují identifikované struktury píků.