CT02
Kit de ensayo de crecimiento celular MTT
MTT Cell Growth Assay is a colorimetric assay that can be used for either proliferation or complement-mediated cytotoxicity assays.
Sinónimos:
Formazan-based mitochondria cytotoxicity assay
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About This Item
UNSPSC Code:
12352207
eCl@ss:
32161000
NACRES:
NA.32
Productos recomendados
Quality Level
manufacturer/tradename
Chemicon®
technique(s)
activity assay: suitable
cell based assay: suitable
shipped in
wet ice
General description
El MTT es un sustrato amarillo pálido que es escindido por las células vivas para producir un producto formazán de color azul oscuro. Este proceso requiere mitocondrias activas; incluso las células recién muertas no escinden cantidades significativas de TTM. El ensayo colorimétrico que se describe a continuación puede utilizarse para ensayos de proliferación o de citotoxicidad mediados por complemento.
Application
Procedimiento:
1) Realice un ensayo de citotoxicidad mediada por linfocina, mitógeno o complemento utilizando los métodos convencionales, en placas de cultivo tisular de fondo plano y 96 pocillos de buena calidad óptica (p. ej. Falcon). El volumen final de medio de cultivo tisular en cada pocillo debe ser de 0,1 ml y el medio (por ejemplo, RPMI o DMEM) puede contener hasta un 10 % de suero fetal bovino.
2) Al final del ensayo, añada 0,01 ml de disolución AB (MTT) a cada pocillo. Mezcle golpeando suavemente el lateral de la bandeja
3) Incube a 37° C para que se produzca la escisión del MTT. Los tiempos óptimos pueden variar según el ensayo, pero cuatro horas es adecuado para la mayoría de los propósitos. Al final de este tiempo, el formazán MTT producido en los pocillos que contienen células vivas aparecerá como cristales negros y borrosos en el fondo del pocillo.
4) Añada 0,1 ml de isopropanol con HCl 0,04 N a cada pocillo. Mezcle bien pipeteando repetidamente con una pipeta multicanal. El HCl convierte el rojo fenol del medio de cultivo tisular en un color amarillo que no interfiere en la medición del formazán procedente del MTT. El isopropanol disuelve el formazán para dar una disolución azul homogénea adecuada para medir la absorbancia.
5) Al cabo de una hora, mida la absorbancia en un lector de placas ELISA con una longitud de onda de análisis de 570 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm. Después de varias horas a temperatura ambiente, las proteínas séricas pueden comenzar a precipitar debido al ácido/alcohol. Enfriar las placas acelerará la precipitación. Si las placas deben almacenarse antes de la medición, consérvelas a 4° C antes de añadir ácido/alcohol, caliéntelas luego a temperatura ambiente y añada ácido/alcohol justo antes de la lectura.
Resultados:
El ensayo MTT normalmente detectará de 200 a 50 000 células de una línea celular típica, aunque el intervalo útil es de 1 000 a 50 000. Este número puede variar para otros tipos de células. Los ensayos de citotoxicidad deben configurarse de modo que las células control no lisadas den una señal de 0,2 a 0,4, y los ensayos de proliferación produzcan un valor similar a concentraciones meseta. Esto corresponde a unas 20-50 000 células por pocillo con una línea celular típica.
La absorbancia es directamente proporcional al número de células; las células reales no absorben de manera significativa, incluso hasta concentraciones de 1 x 106 células/ml.
1) Realice un ensayo de citotoxicidad mediada por linfocina, mitógeno o complemento utilizando los métodos convencionales, en placas de cultivo tisular de fondo plano y 96 pocillos de buena calidad óptica (p. ej. Falcon). El volumen final de medio de cultivo tisular en cada pocillo debe ser de 0,1 ml y el medio (por ejemplo, RPMI o DMEM) puede contener hasta un 10 % de suero fetal bovino.
2) Al final del ensayo, añada 0,01 ml de disolución AB (MTT) a cada pocillo. Mezcle golpeando suavemente el lateral de la bandeja
3) Incube a 37° C para que se produzca la escisión del MTT. Los tiempos óptimos pueden variar según el ensayo, pero cuatro horas es adecuado para la mayoría de los propósitos. Al final de este tiempo, el formazán MTT producido en los pocillos que contienen células vivas aparecerá como cristales negros y borrosos en el fondo del pocillo.
4) Añada 0,1 ml de isopropanol con HCl 0,04 N a cada pocillo. Mezcle bien pipeteando repetidamente con una pipeta multicanal. El HCl convierte el rojo fenol del medio de cultivo tisular en un color amarillo que no interfiere en la medición del formazán procedente del MTT. El isopropanol disuelve el formazán para dar una disolución azul homogénea adecuada para medir la absorbancia.
5) Al cabo de una hora, mida la absorbancia en un lector de placas ELISA con una longitud de onda de análisis de 570 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm. Después de varias horas a temperatura ambiente, las proteínas séricas pueden comenzar a precipitar debido al ácido/alcohol. Enfriar las placas acelerará la precipitación. Si las placas deben almacenarse antes de la medición, consérvelas a 4° C antes de añadir ácido/alcohol, caliéntelas luego a temperatura ambiente y añada ácido/alcohol justo antes de la lectura.
Resultados:
El ensayo MTT normalmente detectará de 200 a 50 000 células de una línea celular típica, aunque el intervalo útil es de 1 000 a 50 000. Este número puede variar para otros tipos de células. Los ensayos de citotoxicidad deben configurarse de modo que las células control no lisadas den una señal de 0,2 a 0,4, y los ensayos de proliferación produzcan un valor similar a concentraciones meseta. Esto corresponde a unas 20-50 000 células por pocillo con una línea celular típica.
La absorbancia es directamente proporcional al número de células; las células reales no absorben de manera significativa, incluso hasta concentraciones de 1 x 106 células/ml.
Components
Reactivo A: MTT, (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio), 50 mg/vial.
Disolución B: PBS pH 7,4, 15 ml
Disolución B: PBS pH 7,4, 15 ml
Storage and Stability
Conservar entre 2- 8°C durante un máximo de seis meses. La mezcla de reactivo A / disolución B es estable a 2-8°C durante un máximo de dos semanas.
Preparación del reactivo:
Añada 10 ml de la disolución B a un vial del reactivo A. Mezcle bien, esterilice mediante filtración y mantenga a 4° C en oscuridad hasta que se utilice. Nota: Puede tardar toda la noche en disolverse. No caliente la disolución. Cuando sea absolutamente necesario disolver cristales, ajuste el pH con 1-2 gotas de HCl. La mezcla AB es estable durante varias semanas en estas condiciones.
Preparación del reactivo:
Añada 10 ml de la disolución B a un vial del reactivo A. Mezcle bien, esterilice mediante filtración y mantenga a 4° C en oscuridad hasta que se utilice. Nota: Puede tardar toda la noche en disolverse. No caliente la disolución. Cuando sea absolutamente necesario disolver cristales, ajuste el pH con 1-2 gotas de HCl. La mezcla AB es estable durante varias semanas en estas condiciones.
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