HPLC de moléculas grandes

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HPLC de fase inversa para biomoléculas

La HPLC de fase inversa (RP-HPLC) es una técnica sensible y versátil que se utiliza para separar y analizar proteínas, fragmentos de proteínas y péptidos. En la RP-HPLC se utiliza una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. La retención de proteínas y péptidos en la fase estacionaria sigue los principios de la adsorción y la partición. Las regiones hidrófobas de las proteínas se adhieren de forma reversible a la fase estacionaria. Las proteínas se hacen eluir aumentando la naturaleza no polar de la fase móvil. La resolución puede verse afectada por el tamaño del poro, el tamaño de la partícula, la longitud de la columna y la cadena hidrocarbonada unida a la fase estacionaria.

Cromatografía por exclusión de tamaño (SEC)

La cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) es un modo de cromatografía no desnaturalizante que separa las moléculas por su tamaño (es decir, radio hidrodinámico). Este modo no depende de la interacción del analito con la fase estacionaria, sino en el flujo aleatorio del analito a través de las partículas de la fase estacionaria. Los analitos de mayor peso molecular eluyen antes, ya que son total o parcialmente excluidos de los poros que quedan entre las partículas de la fase estacionaria, mientras que los analitos de menor peso molecular eluyen más tarde, ya que pasan más tiempo navegando por el tortuoso camino que queda a través de las partículas. La SEC se ha utilizado para caracterizar agregados y fragmentos de anticuerpos monoclonales (AcM), estimar los pesos moleculares desconocidos de proteínas y determinar la estabilidad de la formulación proteica.

Cromatografía de interacción hidrófoba (HIC)

La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) es un modo de cromatografía que separa los analitos en función del grado de interacción entre las restos hidrófobos de los analitos y los ligandos hidrófobos de la fase estacionaria. Debido a su menor peso molecular y a su menor propensión al plegado, la HIC en general no se utiliza en la separación de péptidos. A concentraciones salinas elevadas, las capas de hidratación de las proteínas pueden alterarse lo suficiente como para que las regiones hidrófobas de la superficie interaccionen con la fase estacionaria no polar. La selección de la sal viene dictada por la serie de Hofmeister, que clasifica los cationes y los aniones por su capacidad de alterar las capas de hidratación de las proteínas (caotrópicas) o de promover la formación de capas de hidratación en las proteínas (cosmotrópicas). Las sales típicas son el sulfato de amonio, el sulfato de potasio y el sulfato de sodio. La cromatografía de interacción hidrófoba se está utilizando actualmente para determinar el perfil del cociente fármaco a anticuerpo (DAR) de los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC).

Cromatografía de intercambio iónico (IEX)

La cromatografía de intercambio iónico (IEX) es un modo de cromatografía que separa los analitos por la carga. Las proteínas y los péptidos son anfóteros, lo que significa que presentan funcionalidades ácidas y básicas. Las funcionalidades ácidas de las proteínas son el ácido aspártico, el ácido glutámico, la cisteína, la tirosina y el α-carboxilato C-terminal. Las funcionalidades básicas de las proteínas son la arginina, la histidina, la lisina y la α-amina N-terminal. La IEX puede detectar y resolver las variantes de carga bioterapéutica. Las variantes de carga pueden surgir de la traducción incorrecta del transcrito ARN mensajero (ARNm) o de las modificaciones postraduccionales, como la desamidación, la oxidación o la glucosilación.

La columna de IEX debe seleccionarse en función del punto isoeléctrico (pI) del analito.  Si el pH de la fase móvil es inferior al pI, el analito estará cargado positivamente y se unirá a una columna de intercambio de cationes.  Si el pH de la fase móvil está por encima del pI, el analito estará cargado negativamente y se unirá a una columna de intercambio de aniones.

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad se basa en una interacción específica entre un analito y un ligando de la fase estacionaria. Idealmente sólo el analito de interés interacciona con la fase estacionaria, permitiendo que todos los demás componentes de la muestra atraviesen la columna. A continuación, se pasa una segunda fase móvil a través de la columna para eluir el analito.

La cromatografía de proteína A es la forma de cromatografía de afinidad más común empleada en la industria biofarmacéutica.  La proteína A es una proteína de superficie de 42 kDa que se encuentra en la pared celular de S. aureus.  Esta proteína se une específicamente a la cadena pesada de las IgG en la región Fc, lo que hace de éste un mecanismo ideal para separar las IgG de otros componentes de la muestra.  La mayoría de las columnas de proteína A se fabrican inmovilizando la proteína en una partícula orgánica porosa.  Sin embargo, se ha producido un formato monolítico para la cromatografía de proteína A, que permite un alto rendimiento de la muestra a diversos caudales, sin sacrificar la eficiencia.

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