Antikörper-Grundlagen

• Basisstruktur von Antikörpern
• Antikörperklassen und -subklassen
• Antikörperformen

Basisstruktur von Antikörpern

Immunglobuline (Ig) werden von B-Lymphozyten produziert und in Plasma abgesondert. Das Ig-Molekül in monomerer Form ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 150 kDa, das in seiner Form einem Y ähnelt. Die Grundstruktur des Ig-Monomers (Abbildung 1) besteht aus zwei identischen Hälften, die durch zwei Disulfidbindungen verbunden sind. Jede Hälfte besteht aus einer Schwerkette von etwa 50 kDa und einer Leichtkette von etwa 25 kDa, die durch eine Disulfidbindung in der Nähe des Carboxylterminus der Leichtkette verbunden sind. Die Schwerkette ist unterteilt in ein Fc-Fragment, das sich am Carboxylterminus (Basis von Y) befindet, und ein Fab-Fragment, das sich am Aminoterminus (Arm von Y) befindet. Am Fc-Fragment sind Kohlenhydratketten angebracht. Das Fc-Fragment des Ig-Moleküls besteht ausschließlich aus Schwerketten. Die Fc-Regionen von IgG und IgM können an Rezeptoren auf der Oberfläche von immunmodulierenden Zellen wie Makrophagen binden und die Freisetzung von Cytokinen anregen, welche die Immunantwort regulieren. Die Fc-Region enthält Proteinsequenzen, die allen Ig gemeinsam sind, sowie Determinanten, die ausschließlich zu einzelnen Klassen gehören. Diese Regionen werden als konstante Regionen bezeichnet, da sie sich in verschiedenen Ig-Molekülen innerhalb derselben Klasse nicht wesentlich unterscheiden. Das Fab-Fragment des Ig-Moleküls enthält sowohl Schwer- als auch Leichtketten, die durch eine einzelne Disulfidbindung miteinander verbunden sind. Ein Schwer- und ein Leichtkettenpaar bilden zusammen die Antigenbindungsstelle des Antikörpers. Jedes Ig-Monomer ist in der Lage, zwei Antigenmoleküle zu binden. 

Abbildung 1. Basisstruktur von Immunglobulinen.

Antikörperklassen und -subklassen

Die wichtigsten Immunglobulin (Ig)-Klassen (Abbildung 2) sind IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Auch Vögel produzieren IgY, und zwar im Eigelb.

Abbildung 2. Die wichtigsten Immunglobulinklassen.

Die Klassenidentität wird durch klassenspezifische Sequenzen in der Fc-Region der Schwerkette bestimmt, die mit griechischen Buchstaben bezeichnet werden, welche die Ig-Bezeichnung ergänzen: alpha-IgA, delta-IgD, epsilon-IgE, gamma-IgG, mu-IgM. Leichtketten sind unter den Immunglobulinen universal und kommen in Form zweier Typen vor – Kappa oder Lambda. Diese werden in der Regel mit den griechischen Buchstaben Kappa und Lambda bezeichnet. Eigenschaften von Human- bzw. Maus-Immunglobulinen sind in Tabelle A und Tabelle B enthalten.

Tabelle A

Eigenschaften humaner Immunglobuline
Eigenschaft	IgG				IgA		IgM	IgD	IgE
H Kettenklasse (Schwerkette)	γ				α		µ	δ	ε
H Ketten-Subklassen	γ1	γ2	γ3	γ4	α1	α2	Keine	Keine	Keine
H Ketten-MW	50 kDa	50 kDa	60 kDa	50 kDa	55 kDa	55 kDa	70 kDa	62 kDa	70 kDa
L Ketten-MW* (Leichtkette k & λ)	23 kDa	23 kDa	23 kDa	23 kDa	23 kDa	23 kDa	23 kDa	23 kDa	23 kDa
MW gesamt	150 kDa	150 kDa	170 kDa	150 kDa	160 kDa (Serum) 600 kDa (sekretorisch)	160 kDa (Serum) 600 kDa (sekretorisch)	970 kDa	180 kDa	190 kDa
Ext. Koeff. 0,1 % @280 nm	1,4	1,4	1,4	1,4	1,32	1,32	1,18	1,7	1,53
Komplement-Fixierung	schwach	schwach	stark	nein	nein	nein	stark	nein	nein
Fc-Rezeptor-Bindung	stark	schwach	stark	schwach	ja	ja	ja	nein	ja
Mastzellen-/Basophilen-Degranulation	nein	nein	nein	nein	nein	nein	nein	nein	ja
Plazentarer Transfer	stark	schwach	stark	stark	nein	nein	nein	nein	nein

* Leichtketten sind in allen Immunglobulinklassen vorhanden. Beim Menschen werden in 67 % der Fälle κ-Ketten und in 33 % der Fälle λ-Ketten vorgefunden. Verhältnisse anderer Spezies sind in der Tabelle der Verhältnisse der Leichtketten von Immunglobulinen enthalten.

Tabelle B

Eigenschaften von Maus-Immunglobulinen
Eigenschaft	IgG				IgA	IgM	IgD	IgE
H Ketten-Klasse	γ				α	µ	δ	ε
H Ketten-Subklassen	γ1	γ2a	γ2b	γ3	Keine	Keine	Keine	Keine
0 % von Gesamt-LPG	46	24	27	2
Leichtketten	Ungefähr 95 % Kappa (κ LC) – 5 % Lambda (λ LC)
Molekulargewicht (kDa)	160				160 (Monomer) 350-400	900	180	190
Konzentration des Normalserums (mg/ml)	0,3-5,0	0,1-4,0	0,1-5	0,1-0,2	0,01-0,03	0,1-1,6	0,003-0,01	0,0001-0,001
Serum-Halbwertszeit (Tage)	8-11	3-12	2,6-3,5	4-8	0,5-1	0,5-1	< 1	< 1
Elektrophoretische Mobilität	Schnell	Langsam	Langsam	Langsam
Kohlenhydrate (%)	2-3				7-11	9-12	12-15	12
Komplement-Fixierung	-	+++	+++	+/-	-	+++	nb	nb
Ext. Koeff. 0,1 % @280 nm	1,4				1,35	1,18
Sedimentationskoeff.	6,6				6,7	19	6,8	8

Das Verhältnis von kappa zu lambda in der Ig-Population ist je nach Spezies unterschiedlich. Siehe Tabelle C.

Tabelle C

Leichtketten-Verhältnisse von Immunglobulinen
Spezies	% k / λ
Mensch	67/33
Maus	99/1
Ratte	99/1
Kaninchen	90/10
Ziege	1/99
Schaf	1/99
Schwein	50/50
Rind	1/99
Pferd	1/99
Huhn	N/A

Antikörperformen

Wir bieten Antikörper als ganze (intakte) Moleküle und als F(ab)₂ Fragmente von Antikörpern an. In Tabelle D sind einige häufig vorkommende Antikörperformen dargestellt.

Tabelle D

Antikörperform	Beschreibung	Anwendungen
Gesamt-Antiserum	Das Gesamt-Antiserum enthält neben dem spezifischen Antikörper auch alle anderen Proteine des Wirtsserums.
Fraktioniertes Antiserum (Ig-Fraktion)	Das Gesamt-Antiserum wird fraktioniert, um primär die Immunglobulinfraktion des Antiserums zu erhalten. Diese Fraktion kann geringe Mengen der anderen Wirtsserumproteine enthalten.	IgG-Fraktionen und fraktioniertes Antiserum können in Situationen, in denen eine sehr hohe Affinität erforderlich ist, als nützlich angesehen werden, vor allem wenn das Zielantigen selten oder nur in geringer Menge vorhanden ist. IgG-Fraktionen können den Vorteil haben, dass sie Antikörper mit sehr hoher Affinität enthalten. Bei der Isolierung durch Affinität können einige Antikörper mit sehr hoher Affinität entfernt werden, da sie so fest an die Affinitätsmatrix binden, dass sie nicht eluiert werden.
IgG-Fraktion des Antiserums	Das Gesamt-Antiserum wird fraktioniert und dann durch Ionenaustauschchromatographie weiter aufgereinigt, um die IgG-Fraktion des Antiserums zu erhalten. Diese Fraktion ist im Wesentlichen frei von anderen Proteinen des Wirtsserums.	IgG-Fraktionen und fraktioniertes Antiserum können in Situationen, in denen eine sehr hohe Affinität erforderlich ist, als nützlich angesehen werden, vor allem wenn das Zielantigen selten oder nur in geringer Menge vorhanden ist. IgG-Fraktionen können den Vorteil haben, dass sie Antikörper mit sehr hoher Affinität enthalten. Bei der Isolierung durch Affinität können einige Antikörper mit sehr hoher Affinität entfernt werden, da sie so fest an die Affinitätsmatrix binden, dass sie nicht eluiert werden.
Affinitätsgereinigte Antikörper (AIA)	Diese Produkte sind am stärksten aufgereinigt und weisen daher die geringste Menge unspezifischer Bindungen auf. Affinitätsgereinigte antigenspezifische Antikörper werden durch immunspezifische Aufreinigung mit Antigen-gebundener Agarose aus Antiserum gewonnen, bei der im Wesentlichen alle Wirtsserumproteine, einschließlich Immunglobuline, die nicht spezifisch an das Antigen binden, entfernt werden.	Universal
Aszitesflüssigkeit	Aszitesflüssigkeit ist eine intraperitoneale Flüssigkeit, die Mäusen entnommen wird, denen Hybridomzellen, die spezifische monoklonale Antikörper exprimieren, in die Peritonealhöhle injiziert wurden, die als Wachstumskammer für die Zellen dient. Die Hybridomzellen wachsen zu einer hohen Dichte heran und sezernieren hochtitrige Antikörper. Die Aszitesflüssigkeit wird durch Zentrifugation geklärt, um die Lipidschicht und das Zellpellet zu entfernen. Sie enthält spezifische Antikörper sowie andere Proteine des Wirtsserums, darunter Immunglobuline. Die spezifische Antikörperkonzentration liegt zwischen 1 und 10 mg/ml. Die Gesamtproteinkonzentration beträgt etwa 20 mg/ml.	Universal
Überstand aus Gewebekulturen	Der Überstand ist die Flüssigkeit, die bei der Zentrifugation von Hybridomen in Gewebekultur entsteht, die spezifische monoklonale Antikörper sezernieren. Die Überstände enthalten daher in der Regel Nährmedium und 5–10 % fötales Kälberserum. Die spezifische Antikörperkonzentration liegt im Bereich von 5-50 g/ml.	Universal
Aufgereinigtes Immunglobulin	Aufgereinigtes Immunglobulin bezieht sich in der Regel auf monoklonale Antikörper, die durch Protein-A- oder Protein-G-Affinitätschromatographie aufgereinigt wurden.	Universal
F(ab)2 Fragment	F(ab)2-Fragmente werden durch Verdau von IgG mit Pepsin hergestellt, wobei ein zweiwertiges Molekül (mit zwei Antikörper-Bindungsstellen) entsteht, dem jedoch das Fc-Fragment fehlt.	F(ab)2 Antikörperfragmente werden in Assaysystemen verwendet, bei denen das Vorhandensein der Fc-Region Probleme verursachen kann. Proben wie Lymphknoten, Milz und periphere Blutpräparate enthalten Zellen mit Fc-Rezeptoren (Makrophagen, B-Lymphozyten und natürliche Killerzellen), welche die Fc-Region intakter Antikörper binden können, woraus eine starke Hintergrundfärbung resultiert. Durch die Verwendung von F(ab)2 Fragmenten wird sichergestellt, dass die beobachtete Antikörperbindung nicht auf Fc-Rezeptoren zurückzuführen ist.1 Diese Fragmente können auch für die Färbung von Zellpräparaten in Gegenwart von Plasma wünschenswert sein, da sie kein Komplement binden können, das die Zellen lysieren könnte. F(ab)2 Fragmente sind aufgrund ihrer geringeren Größe in der Lage, Antigen genauer zu lokalisieren als intaktes IgG, insbesondere bei der Färbung von Gewebe für die Elektronenmikroskopie. Die Divalenz der F(ab)2 Fragmente ermöglicht die Vernetzung von Antigenen, sodass diese Reagenzien in Präzipitationsassays, Rosettierungsassays2 oder für die Zellaggregation über Oberflächenantigene eingesetzt werden können.3

Literatur

1. K S, T A, T T. 1998. Decreased Fcgamma receptor III (CD16) expression on peripheral blood mononuclear cells in patients with Sjögren's syndrome. 25 4 689-96. J Rheumatol.

2. DESAINTMARTIN J, SCHWARTZ J, MANNESSIER L, EYQUEM A. 1983. Idiotypic and anti-idiotypic determinants on lymphocytes during anti-Rh immunization. Revue Francaise de Transfusion et Immuno-hématologie. 26(6):573-583. https://doi.org/10.1016/s0338-4535(83)80072-5

3. De Reys S, Hoylaerts M, De Ley M, Vermylen J, Deckmyn H. 1994. Fc-independent cross-linking of a novel platelet membrane protein by a monoclonal antibody causes platelet activation. 84(2):547-555. https://doi.org/10.1182/blood.v84.2.547.547