Antikörper-Grundlagen
Basisstruktur von Antikörpern
Immunglobuline (Ig) werden von B-Lymphozyten produziert und in Plasma abgesondert. Das Ig-Molekül in monomerer Form ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 150 kDa, das in seiner Form einem Y ähnelt. Die Grundstruktur des Ig-Monomers (Abbildung 1) besteht aus zwei identischen Hälften, die durch zwei Disulfidbindungen verbunden sind. Jede Hälfte besteht aus einer Schwerkette von etwa 50 kDa und einer Leichtkette von etwa 25 kDa, die durch eine Disulfidbindung in der Nähe des Carboxylterminus der Leichtkette verbunden sind. Die Schwerkette ist unterteilt in ein Fc-Fragment, das sich am Carboxylterminus (Basis von Y) befindet, und ein Fab-Fragment, das sich am Aminoterminus (Arm von Y) befindet. Am Fc-Fragment sind Kohlenhydratketten angebracht. Das Fc-Fragment des Ig-Moleküls besteht ausschließlich aus Schwerketten. Die Fc-Regionen von IgG und IgM können an Rezeptoren auf der Oberfläche von immunmodulierenden Zellen wie Makrophagen binden und die Freisetzung von Cytokinen anregen, welche die Immunantwort regulieren. Die Fc-Region enthält Proteinsequenzen, die allen Ig gemeinsam sind, sowie Determinanten, die ausschließlich zu einzelnen Klassen gehören. Diese Regionen werden als konstante Regionen bezeichnet, da sie sich in verschiedenen Ig-Molekülen innerhalb derselben Klasse nicht wesentlich unterscheiden. Das Fab-Fragment des Ig-Moleküls enthält sowohl Schwer- als auch Leichtketten, die durch eine einzelne Disulfidbindung miteinander verbunden sind. Ein Schwer- und ein Leichtkettenpaar bilden zusammen die Antigenbindungsstelle des Antikörpers. Jedes Ig-Monomer ist in der Lage, zwei Antigenmoleküle zu binden.
Abbildung 1.Basisstruktur von Immunglobulinen.
Abbildung 2.Die wichtigsten Immunglobulinklassen.
Die Klassenidentität wird durch klassenspezifische Sequenzen in der Fc-Region der Schwerkette bestimmt, die mit griechischen Buchstaben bezeichnet werden, welche die Ig-Bezeichnung ergänzen: alpha-IgA, delta-IgD, epsilon-IgE, gamma-IgG, mu-IgM. Leichtketten sind unter den Immunglobulinen universal und kommen in Form zweier Typen vor – Kappa oder Lambda. Diese werden in der Regel mit den griechischen Buchstaben Kappa und Lambda bezeichnet. Eigenschaften von Human- bzw. Maus-Immunglobulinen sind in Tabelle A und Tabelle B enthalten.
| Eigenschaften humaner Immunglobuline | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Eigenschaft | IgG | IgA | IgM | IgD | IgE | ||||
| H Kettenklasse (Schwerkette) | γ | α | µ | δ | ε | ||||
| H Ketten-Subklassen | γ1 | γ2 | γ3 | γ4 | α1 | α2 | Keine | Keine | Keine |
| H Ketten-MW | 50 kDa | 50 kDa | 60 kDa | 50 kDa | 55 kDa | 55 kDa | 70 kDa | 62 kDa | 70 kDa |
| L Ketten-MW* (Leichtkette k & λ) | 23 kDa | 23 kDa | 23 kDa | 23 kDa | 23 kDa | 23 kDa | 23 kDa | 23 kDa | 23 kDa |
| MW gesamt | 150 kDa | 150 kDa | 170 kDa | 150 kDa | 160 kDa (Serum) 600 kDa (sekretorisch) | 160 kDa (Serum) 600 kDa (sekretorisch) | 970 kDa | 180 kDa | 190 kDa |
| Ext. Koeff. 0,1 % @280 nm | 1,4 | 1,4 | 1,4 | 1,4 | 1,32 | 1,32 | 1,18 | 1,7 | 1,53 |
| Komplement-Fixierung | schwach | schwach | stark | nein | nein | nein | stark | nein | nein |
| Fc-Rezeptor-Bindung | stark | schwach | stark | schwach | ja | ja | ja | nein | ja |
| Mastzellen-/Basophilen-Degranulation | nein | nein | nein | nein | nein | nein | nein | nein | ja |
| Plazentarer Transfer | stark | schwach | stark | stark | nein | nein | nein | nein | nein |
* Leichtketten sind in allen Immunglobulinklassen vorhanden. Beim Menschen werden in 67 % der Fälle κ-Ketten und in 33 % der Fälle λ-Ketten vorgefunden. Verhältnisse anderer Spezies sind in der Tabelle der Verhältnisse der Leichtketten von Immunglobulinen enthalten.
| Eigenschaften von Maus-Immunglobulinen | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Eigenschaft | IgG | IgA | IgM | IgD | IgE | |||
| H Ketten-Klasse | γ | α | µ | δ | ε | |||
| H Ketten-Subklassen | γ1 | γ2a | γ2b | γ3 | Keine | Keine | Keine | Keine |
| 0 % von Gesamt-LPG | 46 | 24 | 27 | 2 | ||||
| Leichtketten | Ungefähr 95 % Kappa (κ LC) – 5 % Lambda (λ LC) | |||||||
| Molekulargewicht (kDa) | 160 | 160 (Monomer) 350-400 | 900 | 180 | 190 | |||
| Konzentration des Normalserums (mg/ml) | 0,3-5,0 | 0,1-4,0 | 0,1-5 | 0,1-0,2 | 0,01-0,03 | 0,1-1,6 | 0,003-0,01 | 0,0001-0,001 |
| Serum-Halbwertszeit (Tage) | 8-11 | 3-12 | 2,6-3,5 | 4-8 | 0,5-1 | 0,5-1 | < 1 | < 1 |
| Elektrophoretische Mobilität | Schnell | Langsam | Langsam | Langsam | ||||
| Kohlenhydrate (%) | 2-3 | 7-11 | 9-12 | 12-15 | 12 | |||
| Komplement-Fixierung | - | +++ | +++ | +/- | - | +++ | nb | nb |
| Ext. Koeff. 0,1 % @280 nm | 1,4 | 1,35 | 1,18 | |||||
| Sedimentationskoeff. | 6,6 | 6,7 | 19 | 6,8 | 8 | |||
Das Verhältnis von kappa zu lambda in der Ig-Population ist je nach Spezies unterschiedlich. Siehe Tabelle C.
| Leichtketten-Verhältnisse von Immunglobulinen | |
|---|---|
| Spezies | % k / λ |
| Mensch | 67/33 |
| Maus | 99/1 |
| Ratte | 99/1 |
| Kaninchen | 90/10 |
| Ziege | 1/99 |
| Schaf | 1/99 |
| Schwein | 50/50 |
| Rind | 1/99 |
| Pferd | 1/99 |
| Huhn | N/A |
| Antikörperform | Beschreibung | Anwendungen |
|---|---|---|
| Gesamt-Antiserum | Das Gesamt-Antiserum enthält neben dem spezifischen Antikörper auch alle anderen Proteine des Wirtsserums. | |
| Fraktioniertes Antiserum (Ig-Fraktion) | Das Gesamt-Antiserum wird fraktioniert, um primär die Immunglobulinfraktion des Antiserums zu erhalten. Diese Fraktion kann geringe Mengen der anderen Wirtsserumproteine enthalten. | IgG-Fraktionen und fraktioniertes Antiserum können in Situationen, in denen eine sehr hohe Affinität erforderlich ist, als nützlich angesehen werden, vor allem wenn das Zielantigen selten oder nur in geringer Menge vorhanden ist. IgG-Fraktionen können den Vorteil haben, dass sie Antikörper mit sehr hoher Affinität enthalten. Bei der Isolierung durch Affinität können einige Antikörper mit sehr hoher Affinität entfernt werden, da sie so fest an die Affinitätsmatrix binden, dass sie nicht eluiert werden. |
| IgG-Fraktion des Antiserums | Das Gesamt-Antiserum wird fraktioniert und dann durch Ionenaustauschchromatographie weiter aufgereinigt, um die IgG-Fraktion des Antiserums zu erhalten. Diese Fraktion ist im Wesentlichen frei von anderen Proteinen des Wirtsserums. | IgG-Fraktionen und fraktioniertes Antiserum können in Situationen, in denen eine sehr hohe Affinität erforderlich ist, als nützlich angesehen werden, vor allem wenn das Zielantigen selten oder nur in geringer Menge vorhanden ist. IgG-Fraktionen können den Vorteil haben, dass sie Antikörper mit sehr hoher Affinität enthalten. Bei der Isolierung durch Affinität können einige Antikörper mit sehr hoher Affinität entfernt werden, da sie so fest an die Affinitätsmatrix binden, dass sie nicht eluiert werden. |
| Affinitätsgereinigte Antikörper (AIA) | Diese Produkte sind am stärksten aufgereinigt und weisen daher die geringste Menge unspezifischer Bindungen auf. Affinitätsgereinigte antigenspezifische Antikörper werden durch immunspezifische Aufreinigung mit Antigen-gebundener Agarose aus Antiserum gewonnen, bei der im Wesentlichen alle Wirtsserumproteine, einschließlich Immunglobuline, die nicht spezifisch an das Antigen binden, entfernt werden. | Universal |
| Aszitesflüssigkeit | Aszitesflüssigkeit ist eine intraperitoneale Flüssigkeit, die Mäusen entnommen wird, denen Hybridomzellen, die spezifische monoklonale Antikörper exprimieren, in die Peritonealhöhle injiziert wurden, die als Wachstumskammer für die Zellen dient. Die Hybridomzellen wachsen zu einer hohen Dichte heran und sezernieren hochtitrige Antikörper. Die Aszitesflüssigkeit wird durch Zentrifugation geklärt, um die Lipidschicht und das Zellpellet zu entfernen. Sie enthält spezifische Antikörper sowie andere Proteine des Wirtsserums, darunter Immunglobuline. Die spezifische Antikörperkonzentration liegt zwischen 1 und 10 mg/ml. Die Gesamtproteinkonzentration beträgt etwa 20 mg/ml. | Universal |
| Überstand aus Gewebekulturen | Der Überstand ist die Flüssigkeit, die bei der Zentrifugation von Hybridomen in Gewebekultur entsteht, die spezifische monoklonale Antikörper sezernieren. Die Überstände enthalten daher in der Regel Nährmedium und 5–10 % fötales Kälberserum. Die spezifische Antikörperkonzentration liegt im Bereich von 5-50 g/ml. | Universal |
| Aufgereinigtes Immunglobulin | Aufgereinigtes Immunglobulin bezieht sich in der Regel auf monoklonale Antikörper, die durch Protein-A- oder Protein-G-Affinitätschromatographie aufgereinigt wurden. | Universal |
| F(ab)2 Fragment | F(ab)2-Fragmente werden durch Verdau von IgG mit Pepsin hergestellt, wobei ein zweiwertiges Molekül (mit zwei Antikörper-Bindungsstellen) entsteht, dem jedoch das Fc-Fragment fehlt. | F(ab)2 Antikörperfragmente werden in Assaysystemen verwendet, bei denen das Vorhandensein der Fc-Region Probleme verursachen kann. Proben wie Lymphknoten, Milz und periphere Blutpräparate enthalten Zellen mit Fc-Rezeptoren (Makrophagen, B-Lymphozyten und natürliche Killerzellen), welche die Fc-Region intakter Antikörper binden können, woraus eine starke Hintergrundfärbung resultiert. Durch die Verwendung von F(ab)2 Fragmenten wird sichergestellt, dass die beobachtete Antikörperbindung nicht auf Fc-Rezeptoren zurückzuführen ist.1 Diese Fragmente können auch für die Färbung von Zellpräparaten in Gegenwart von Plasma wünschenswert sein, da sie kein Komplement binden können, das die Zellen lysieren könnte. F(ab)2 Fragmente sind aufgrund ihrer geringeren Größe in der Lage, Antigen genauer zu lokalisieren als intaktes IgG, insbesondere bei der Färbung von Gewebe für die Elektronenmikroskopie. Die Divalenz der F(ab)2 Fragmente ermöglicht die Vernetzung von Antigenen, sodass diese Reagenzien in Präzipitationsassays, Rosettierungsassays2 oder für die Zellaggregation über Oberflächenantigene eingesetzt werden können.3 |
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Literatur
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