Aufreinigung und Qualitätsprüfung von genomischen DNA-Proben
Die Verfügbarkeit von einfachen Verfahren zum Aufreinigen von DNA und RNA hat die Analyse und Charakterisierung des Genoms und der Genexpression in hohem Maß erleichtert. Es besteht eine Anforderung, DNA und RNA schnell und praktisch aus verschiedenen zellulären Quellen, einschließlich Gewebe aus Tier-, Pflanzen- und Bakterienkulturen, zu isolieren. Herkömmliche Ansätze an die DNA-Isolation und -Aufreinigung basieren auf mehrstufigen Verfahren mit Phenol/Chloroform, Anionenaustausch- oder Kieselgelaustauschsystemen. Die Aufreinigung von RNA umfasst in der Regel ein chaotropes Salz und Phenol/Chloroform mit einem weiteren Oligo(dT)-Aufreinigungsschritt, falls mRNA erforderlich ist.
Die Qualität des Matrizenmaterials, das in einer PCR- oder RT-Reaktion enthalten ist, weist eine tiefgreifende Wirkung auf die Verlässlichkeit der resultierenden Daten auf.1 Es ist wichtig, dass die Qualität des Zielmaterials bestimmt und angegeben wird.2 Vorzugsweise wird die Nukleinsäure mit der höchstmöglichen Qualität verwendet. Dieses Kapitel enthält eine umfassende Analyse der Auswirkung der Zielqualität auf die resultierenden qPCR- und RT-qPCR-Daten unter Berücksichtigung von sowohl Reinheit als auch Integrität.
Nukleinsäureaufreinigung
Die Nukleinsäureaufreinigung ist die erste Anforderung für die meisten molekularbiologischen Experimente. DNA- und RNA-Proben werden oftmals aus „rohen“ Präparaten gewonnen. Diese Aufreinigungsverfahren können schnell und direkt sein, und sind besonders nützlich, falls die Proben in PCR/RT-PCR verwendet werden, für die nur eine kleine Menge DNA oder RNA erforderlich ist. Einige Anwendungen erfordern eine Probe, die durch herkömmliche Verfahren aufgereinigt wurde. Die Endanwendung bestimmt das beste Verfahren. Falls die Nukleinsäure aus biologischem Material intakt, rein, konzentriert und frei von Inhibitoren für Downstream-Enzymreaktionen sein soll, erfordern die Extraktionsverfahren die Zugabe von chaotropen Mitteln.
Chaotrope Mittel
Ein chaotropes Mittel ist ein Stoff, der Proteine, DNA oder RNA denaturiert, indem er die dreidimensionale Struktur des Moleküls zerstört. Chaotrope Mittel beeinträchtigen die stabilisierenden intramolekularen Wechselwirkungen, die durch nichtkovalente Kräfte wie Wasserstoffbrückenbindungen, Van-der-Waals-Kräfte und hydrophobe Effekte vermittelt werden. Zu den häufig eingesetzten chaotropen Mitteln gehören Harnstoff (6–8 mmol/l), Guanidin-HCl (6 mmol/l) und Lithiumperchlorat (4,5 mmol/l). Guanidinthiocyanat ist ein potentes Proteindenaturierungsmittel, das stärker als Guanidin-HCl ist und zum Entfernen der RNase-Aktivität oft bei der Isolation von intakter Ribonukleinsäure eingesetzt wird. Viele RNA-Isolationsprotokolle umfassen die Zugabe von Mercaptoethanol als zusätzliches chaotropes Mittel, um eine reduzierende Umgebung zu schaffen, in der die vier Disulfidbindungen, die zwischen den acht Cysteinresten von Ribonuklease A (RNase A) gebildet werden, zu denaturieren. Die Kombination aus einem chaotropen Mittel und einem Reduktionsmittel wie Mercaptoethanol führt zur Entfaltung der Ribonuklease und dem vollständigen Verlust ihrer Aktivität.
Extraktion von genomischer DNA
Rohpräparat
Die Extract-N-Amp™-Kits können zum schnellen und effizienten Extrahieren von PCR-bereiter genomischer DNA (gDNA) aus fast allen Arten von Proben mit einem einfachen Ein-Röhrchen-Protokoll, das abhängig von der Probe 15 Minuten oder kürzer dauert, eingesetzt werden. Die Extract-N-Amp-Kits wurden zum Extrahieren von gDNA aus Proben wie Vollblut, Haarfollikeln, Mäuseschwanzschnitten, Gewebekulturzellen, Zellen aus Wangenschleimhautabstrichen, Drosophila melanogaster, verschiedenen Pflanzen und Samen eingesetzt. Im Gegensatz zu vollständigen Aufreinigungsverfahren vermeidet dieser Ansatz einen mechanischen Aufschluss, eine organische Extraktion, Säulenaufreinigung oder Ausfällung der DNA. Diese Kits enthalten Reagenzien zum Extrahieren und Amplifizieren von DNA, die in vielen Downstream-Anwendungen, einschließlich PCR/qPCR-Analyse, eingesetzt werden kann.
Aufreinigung von genomischer DNA
Die DNA kann aus fast allen zellulären oder Gewebequellen isoliert werden. Die Aufreinigung von gDNA erfordert ihr Entfernen aus der Zelle, während sie vor der Zersetzung geschützt wird. Die Isolationsverfahren müssen außerdem ausreichend sanft sein, um die langen DNA-Stränge vor mechanischem Stress zu schützen. Die Probe wird zuerst in einem Puffer wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), der in der Regel ein Detergens wie Triton™ X-100 oder Natriumdodecylsulfat (SDS) zum Lysen der Zellen und Lösen von Proteinen und Lipiden enthält, geerntet. Proteinase K wird zugegeben, um die verklumpten Zellen und Gewebe zu trennen sowie Enzyme durch proteolytischen Aufschluss zu inaktivieren. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ist ein Chelatbildner, der als Radikalfänger für Metallionen in Lösung dient, und wird zu DNA-Aufreinigungspuffern zugegeben, um Magnesiumionen (Mg2+) zu entfernen. Mg2+ ist ein essenzieller Cofaktor für DNasen, weshalb das Entfernen von Mg2+ DNasen inaktiviert und somit die DNA-Zersetzung verhindert. RNase wird oft beigefügt, um die in den Zellen vorhandene RNA zu zersetzen.
Nach dem Lysen der Zellen und dem Zersetzen der RNA, Proteine und Lipide muss die DNA von den Überresten dieser Materialien getrennt werden. Die klassischen Aufreinigungsverfahren verwenden Phenol/Chloroform3, um die Proteine zu entfernen und die DNA sowie andere wasserlösliche Materialien zurückzulassen. TRI Reagent® nutzt eine Adaption dieses Verfahrens. Alternativ wird die DNA beim Einsatz von Systemen wie den GenElute™-Kits für die gDNA-Aufreinigung in Gegenwart von chaotropen Salzen auf Membranen auf Siliziumdioxidbasis (in Einzelsäulen und 96-Well-Formaten) adsorbiert, wodurch die Proteinstruktur zerstört wird. Beim Aufreinigen von DNA aus Pflanzenmaterial muss das Gewebe zuerst mechanisch zerstört werden, indem es in flüssigem Stickstoff zermahlen wird. Vollblut oder Bakterien werden dagegen mit Enzymen vorinkubiert, um eine effiziente Zelllyse und DNA-Freisetzung sicherzustellen. Die DNA wird gewaschen, während sie an die Membranen gebunden ist und anschließend eluiert, indem die Salzkonzentration verändert wird. Danach wird sie durch ein Detergens und ein chaotropes Mittel freigesetzt. Proteine, Polysaccharide und Zelltrümmer werden mit einem Fällungsverfahren, gefolgt von Zentrifugieren durch eine Filtrationssäule entfernt.
Aufreinigung von Gesamt-RNA
Die Aufreinigung von zellulärer RNA ist für Studien der Genexpression oder anderen Zellfunktionen, die durch RNA reguliert werden, erforderlich. Die Gesamt-RNA ist die RNA, die aus zellulärer DNA (gDNA und mitochondriale DNA, mtDNA) transkribiert wird und sich allgemein auf eine Probe bezieht, die Folgendes enthält: Ribosomale, Transfer- und Boten-RNA (rRNA, tRNA und mRNA), aber keine microRNA (miRNA) oder kleinere nicht kodierende RNA (ncRNA). Gesamt-RNA ist die Fraktion von Interesse, die für die Genexpressionsanalyse isoliert wird.
Die Isolation von RNA ist eine Herausforderung, da Ribonukleaseenzyme (RNasen) in Zellen und Gewebe allgegenwärtig vorkommen und RNA schnell zersetzen. Daher umfasst der Aufreinigungsprozess RNase-Inhibitoren. Das gängigste Verfahren zum Aufreinigen ist die Extraktion mit Guanidiniumthiocyanatphenol/Chloroform. Sie ist das Prinzip hinter dem TRI Reagent®, das eine einphasige Lösung mit Phenol und Guanidinthiocyanat ist. Die Gewebe- oder Zellprobe wird in dem TRI Reagent homogenisiert oder zerstört, Chloroform wird mit dem Lysat gemischt, und anschließend wird die Mischung durch Zentrifugieren in drei Phasen getrennt. Die wässrige Phase, die die RNA enthält, wird entfernt und die RNA wird mit Isopropanol ausgefällt. Die GenElute-RNA-Isolationskits fangen die RNA nach der Zelllyse auf Siliziumdioxidharz. Die GenElute-Kits verwenden Guanidinthiocyanat und 2-Mercaptoethanol, um RNasen bei der Isolation von der gesamten nukleären und zytoplasmischen RNA zu inaktivieren. In Gegenwart von Guanidinthiocyanat werden Proteine leicht gelöst, zelluläre Strukturen zerfallen und Nukleoproteine trennen sich von Nukleinsäuren, wenn die sekundäre Proteinstruktur verloren geht. Da Guanidinthiocyanat potenter als Guanidin-HCl ist, werden RNasen darüber hinaus permanent denaturiert. Lysate werden durch eine Filtrationssäule gesponnen, um Zelltrümmer zu entfernen und DNA zu scheren. Das Filtrat wird anschließend in eine Kieselgelsäule mit hoher Kapazität gegeben, um die Gesamt-RNA zu binden, gefolgt von Waschen und Eluieren mit RNase-freiem Wasser oder Puffer.
Der Großteil der Gesamt-RNA-Probe ist rRNA (~80 %); die mRNA-Fraktion macht dagegen nur 2–5 % aus. Für einige Verfahren kann es wünschenswert sein, die mRNA aus der weitaus reichlicher vorkommenden rRNA und tRNA aufzureinigen. Die GenElute-mRNA-Kits bieten praktische Verfahren zum Isolieren von polyadenylierter mRNA aus zuvor aufbereiteter Gesamt-RNA oder direkt aus Säugetierzellen und -gewebe. Für die direkte mRNA-Aufbereitung werden Zellen oder Gewebe mit SDS/Proteinase-K-Aufschluss zerstört, um RNA freizusetzen und RNasen zu entfernen. Kovalent an 1-µm-Polystyrolkörner gebundenes Oligo(dT)30 wird anschließend verwendet, um polyadenylierte mRNA mittels Hybridisierung einzufangen. Die Polystyrolkörner bleiben während der Hybridisierung suspendiert, wodurch die Notwendigkeit für Mischen oder Schütteln entfällt. Die mRNA-Korn-Komplexe werden auf einem Mikrozentrifugen-Spinfilter gewaschen, und anschließend wird die aufgereinigte mRNA eluiert.
Viele der zum Aufreinigen von „Gesamt-RNA“ verwendeten Verfahren selektieren größere Moleküle und eignen sich daher nicht für die Isolation von kleineren ncRNA, einschließlich miRNA. Es gibt speziell für die Aufreinigung von Fraktionen kleinerer RNA-Spezies entwickelte Kits, die gewählt werden können, wenn dies die Matrix von Interesse ist.
Aufreinigung von microRNA (miRNA) und nicht kodierender RNA (ncRNA)
Die Aufreinigung von miRNA und anderen kleineren ncRNA-Molekülen ist aufgrund ihrer kurzen Länge aufwendiger. Es ist wichtig, ein geeignetes RNA-Isolationsverfahren zu wählen, das kleine RNA zurückhält, und den Einsatz von Aufreinigungskits für Gesamt-RNA zu vermeiden, sofern der Hersteller nicht spezifisch angibt, dass Gesamt-RNA auch kleine RNA mit <100 Basen einschließt. Extraktionsverfahren für ncRNA zielen durch spezifische Säulenbindung oder Ausfällung auf die Unterschiede zwischen RNA-Molekülen und anderen kontaminierenden Faktoren ab. RNAzol® ist eine saure Guanidinthiocyanat-Phenol-Mischung, die Zellen und Gewebe zerstört und durch die Zugabe von Chloroform oder Bromchlorpropan alle RNA-Spezies von Proteinen und DNA trennt. Aufreinigungsverfahren ermöglichen anschließend die separate Aufreinigung von kleiner RNA-, mRNA- oder Gesamt-RNA-Proben, sodass jede dieser Fraktionen parallel in Downstream-Anwendungen analysiert werden kann. Die miRPremier® microRNA-Isolationskits sind Binden-Waschen-Eluieren-Kits auf Siliziumdioxidbasis, die speziell für die Rückgewinnung von kleiner RNA entwickelt wurden. Das miRPremier-Kit nutzt den Ansatz des Aussalzens, um größere Moleküle zu entfernen, bevor kleine RNA an die Säule gebunden wird, da die Ethanolmenge, die zum Binden von kleiner RNA an Kieselgel (Siliziumdioxid) erforderlich ist auch Proteine und andere Makromoleküle ausfällt, wodurch eine viskose Suspension gebildet wird, die Säulen verstopfen und eine effiziente Rückgewinnung von RNA verhindern kann. Ein alternativer Ansatz zum Umgehen dieses Problems ist der Einsatz eines Vorreinigungsschritts zum Entfernen von Makromolekülen, z. B. durch Extrahieren mit RNAzol oder Vorbindungssäulen, sodass ausreichend Alkohol zum Binden von kleiner RNA zugegeben werden kann, ohne die RNA-Bindungssäule zu verstopfen.
Qualitätsprüfung von Nukleinsäureproben
Die Probenhandhabungs- und Nukleinsäurenextraktionsverfahren sind variabel. Darum ist es wichtig, ein verlässliches Protokoll für die Analyse der Probenqualität und -quantität zu definieren sowie Details dieser Analyse in Publikationen zu inkludieren.2 Die Quantität der RNA wird Großteils durch die Ausbeute von rRNA bestimmt, wogegen die Qualität der RNA durch die Reinheit (Abwesenheit von Inhibitoren) und die Integrität der RNA-Moleküle bestimmt wird. Wenn die Qualität einer Probe gemessen wird und die Reinheit und Integrität die Ergebnisse beeinflussen, ist es jedoch schwierig, die Reinheit und Integrität von Proben mit geringer Konzentration zu bestimmen. Das Vorkommen von Verunreinigungen kann die Quantifizierung beeinträchtigen. Es gibt eine Reihe von Techniken, die zum Bewerten der Quantität und Qualität von Nukleinsäuren eingesetzt werden können, aber keine davon kann allein alle Informationen bereitstellen, die zur vollständigen Beschreibung einer Probe erforderlich sind. Daher ist es wichtig, eine Reihe von Optionen in Erwägung zu ziehen, um sicherzustellen, dass die Probenqualität die endgültigen Analysedaten nicht beeinflusst.1
Nukleinsäurenquantifizierung
UV-Spektroskopie
Nukleinsäuren werden traditionell durch die Messung der UV-Absorption mit einem Spektralphotometer quantifiziert. Die Absorption einer verdünnten DNA- oder RNA-Probe wird bei 260 nm und 280 nm gemessen. Die optische Dichte (OD) bei 260 nm wird herangezogen, um die RNA- oder DNA-Konzentration in einer Lösung mittels Lambert-Beer’schem Gesetz zu bestimmen, das eine lineare Korrelation zwischen Absorption und Konzentration berechnet.
Lambert-Beer‘sches Gesetz
A = εbc
A = Absorption
b = Weglänge der Küvette in cm (in der Regel 1 cm)
c = Analytenkonzentration
ε = Extinktionskoeffizient
Für RNA, ε = 40 μg/ml
Für DNA, ε = 50 μg/ml
Ein OD-Wert von 1,0 bei 260 nm (A260) entspricht etwa 40 µg/ml reiner RNA und 50 µg/ml reiner doppelsträngiger DNA. Das Lambert-Beer‘sche Gesetz ist jedoch nur auf OD-Werte von bis zu 2 anwendbar. Die angegebene Beziehung von OD und Konzentration beruht auf reinen Proben. Folglich beeinträchtigen kontaminierende Substanzen mit einer Absorption bei 260 nm oder 280 nm den geschätzten OD-Wert. Reine RNA hat ein Verhältnis von A260/A280 von 2,1, wogegen reine DNA ein Verhältnis von A260/A280 von 1,8 aufweist.
Die OD von potenziellen Verunreinigungen wie Proteinen, chaotropen Salzen und Phenol kann auch bestimmt werden, wenn die Absorption der Probe bei 280 nm und 230 nm gemessen wird (A280 bzw. A230). So kann ein Verhältnis von A260/A280 zu A260/A230 als Indikator für die Reinheit der Probe herangezogen werden. Es sei jedoch angemerkt, dass das Bestimmen einer Protein-Kontamination in DNA mit diesem Ansatz sehr wenig sensitiv ist.4
Außerdem können der pH-Wert und die Ionenstärke des Puffers den OD-Wert beeinträchtigen. Es wurde aufgezeigt, dass das Verhältnis von A260/A280 stark variiert, wenn verschiedene Wasserquellen verwendet werden, um die spektralphotometrischen Messungen durchzuführen. Zum Beispiel führt eine Schwankung des pH-Werts von Wasser, das zum Suspendieren von RNA verwendet wird, von pH-Wert 5,4 bis 7,5–8,5 zu signifikant erhöhten RNA-Verhältnissen von A260/A280 im Bereich von etwa 1,5 bis 2,0.5
Es ist wichtig, dass sowohl das Verhältnis von A260/A280 als auch das Verhältnis von A260/A230 um 2,0 betragen (Tabelle 7.1).
TRIS-, Ethanol- und Isopropanol-Kontamination
Auswirkung einer TRIS-Kontamination: Eine TRIS-Kontamination beeinträchtigt das Absorptionsspektrum von RNA/DNA nicht signifikant.
Auswirkung einer Ethanol-Kontamination: Ethanol hat keine signifikante Auswirkung auf das Absorptionsspektrum von RNA/DNA, wenn in TE-Puffer mit pH-Wert 8,0 gemessen wird. Wird die Messung jedoch in reinem Wasser durchgeführt, kann das Verhältnis von A260/A280 verringert sein. Ein Verhältnis von weniger als 2,0 kann also auf eine Ethanol-Kontamination hinweisen.
Auswirkung einer Isopropanol-Kontamination: Isopropanol hat keine signifikante Auswirkung auf das Absorptionsspektrum von RNA/DNA, wenn in TE-Puffer mit pH-Wert 8,0 gemessen wird. Wird die Messung jedoch in reinem Wasser durchgeführt, kann das Verhältnis von A260/A280 verringert sein. Ein Verhältnis von weniger als 2,0 kann also auf eine Isopropanol-Kontamination hinweisen.
Protein-, Guanidinthiocyanat- und Phenol-Kontamination
Auswirkung einer Protein-Kontamination: Eine Probe, die mit 0,01 % BSA verunreinigt ist, kann ein fast normales Absorptionsspektrum zeigen, obwohl das Verhältnis von A260/A280 unter 1,9 (RNA) oder 1,7 (DNA) fallen kann, was eine Warnung dafür ist, dass etwas die Probe verunreinigt. Bei 0,5 % BSA erscheinen Absorptionspektren abnormal. Dies ist ein deutlicher Hinweis darauf, dass die Probe signifikant verunreinigt ist. Daher können hohe Proteinkonzentrationen durch abnormale Verhältnisse von A260/A280 nachgewiesen werden. Dies gilt jedoch nicht für geringe und moderate Mengen.
Auswirkung einer Guanidinisothiocyanat-Kontamination: Guanidinisothiocyanat hat wenig Einfluss auf das Verhältnis von A260/A280. Daher hat Guanidinisothiocyanat eine geringe Auswirkung auf die Quantifizierung von RNA. Das Vorhandensein von Guanidinisothiocyanat hat jedoch eine sehr starke Auswirkung auf das Verhältnis von A260/A230. Bei einer Kontamination von 0,5 % fällt das Verhältnis von A260/A230 unter 0,5. Proben mit einer vermuteten Guanidinisothiocyanat-Kontamination sollten vermieden werden, da dies eine schädliche Wirkung auf Downstream-Enzymreaktionen hat.
Auswirkung einer Phenol-Kontamination: Phenol hat eine sehr starke Auswirkung auf die Quantifizierung von RNA. Bei einer Phenol-Kontamination von 0,5 % der RNA-Probe bei 50 ng/µl ist die gemessene Konzentration mehr als dreimal größer. Diese starke störende Auswirkung von Phenol auf die Quantifizierung von RNA tritt aufgrund des kontaminierenden Absorptions-Peaks bei 270 nm auf. Bei sehr geringen RNA-Konzentrationen (weniger als 10 ng/µl) wird dieser Kontaminations-Peak oft mit RNA verwechselt. Die RNA-Absorption tritt jedoch immer bei 260 nm auf, niemals bei 270 nm. Daher ist ein Peak bei 270 nm auf eine Verunreinigung zurückzuführen. Nachdem die RNA mit einem auf Phenol basierenden Verfahren isoliert wurde, stellt eine falsche Überschätzung der RNA-Konzentration ein ernstzunehmendes Problem dar. Dies ist insbesondere bei RNA mit geringer Konzentration der Fall.
Automatisierte UV-Spektralphotometrie
Während herkömmliche UV-Spektralphotometrie erfordert, dass die Messungen mit relativ hohen Probenvolumen durchgeführt werden, gibt es nun Systeme wie das NanoDrop® 2000 UV/VIS-Spektralphotometer, die automatisiert sind und hochgradig genaue Analysen von besonders kleinen Probengrößen unterstützen. Die Probenretentionssystem eliminieren die Notwendigkeit für Küvetten und Kapillaren, wodurch die analysierte Probenmenge auf von 0,5 µl bis 2 µl verringert werden kann. Das NanoDrop bietet eine Messung der Absorption von etwa 200 nm bis 350 nm, was dem relevanten Bereich zum Bestimmen der Konzentration und Reinheit von RNA/DNA entspricht.
Fluoreszenzbasierte Nukleinsäurenquantifizierungssysteme
Der Einsatz von fluoreszierenden Farbstoffen zum Quantifizieren von Nukleinsäuren ist eine Alternative zur Absorptionsspektralphotometrie.6,7 Das Bestimmen der Nukleinsäurekonzentration durch Fluoreszenzverfahren nutzt die Bindung von kleinen Molekülen oder Farbstoffen an Nukleinsäuren und misst die daraus resultierenden Änderungen der Fluoreszenzeigenschaften. Obwohl sie teurer als die Absorptionsspektralphotometrie ist, ist die fluoreszenzbasierte Quantifizierung sensitiver, genauer und kann spezifisch für die Nukleinsäure von Interesse sein.
Da Fluorometer die Fluoreszenz in relativen und nicht absoluten Einheiten messen, wird die Messung zuerst mit einer bekannten Konzentration einer Nukleinsäure-Standardlösung mit Eigenschaften, die denen der zu messenden Probe ähneln, kalibriert. Nach der Kalibrierung kann eine einzelne Messung die Konzentration der Nukleinsäure in der Lösung bestimmen. In der Regel ist jedoch eine Standardkurve erforderlich, um die Linearität des Assays im gemessenen Bereich zu ermitteln.
Automatisierte Systeme wie das QuBit® 2.0 Fluorometer (Life Technologies) können mit einer Reihe verschiedener fluoreszenzbasierter Quantifizierungs-Assays zum Messen der Nukleinsäurekonzentration in Lösung eingesetzt werden. Die Assays demonstrieren einen breiten Dynamikumfang für den Nachweis und können kleine Proben genau analysieren.
Es ist wichtig anzumerken, dass der OD-Wert eine Messung der Absorption ist und nicht als vollständige Bewertung der Probenqualität herangezogen werden kann. Ebenso bieten fluoreszenzbasierte Systeme eine Messung der Quantität, nicht der Qualität. Diese können zum Beispiel als Test für die Integrität der Probe verwendet werden, aber es muss auch eine geeignete Analyse durchgeführt werden, z. B. Kapillarelektrophorese, Geltrennung oder 3‘/5‘-Verhältnis-Assay (wie nachstehend beschrieben).
Gelelektrophorese und kapillare Nukleinsäurequalitätsprüfungssysteme
Gelelektrophorese
Obwohl RNA thermodynamisch stabil ist, wird sie in Gegenwart von fast allgegenwärtig vorkommenden RNase-Enzymen schnell aufgeschlossen. Als Resultat kommen kürzere RNA-Fragmente in einer Probe häufig vor, was die Ergebnisse von Downstream-Anwendungen potenziell beeinträchtigen kann. Der Abbauprozess von RNA wird nur teilweise verstanden und hängt von der Art der vorhandenen RNase ab. Auch die Qualität der RNA aus einer bestimmten Extraktion kann stark variieren und muss ständig überwacht werden. Deshalb ist es wichtig, die Integrität der RNA-Proben zu bestimmen.
Um einen potenziellen Abbau zu beurteilen, werden Elektrophoreseverfahren eingesetzt, die die Proben gemäß der Größe der enthaltenen Moleküle trennen. Historisch wurde die Integrität von RNA durch mit Ethidiumbromid gefärbter Agarose-Gelelektrophorese, die ein definiertes Bandenmuster erzeugt, beurteilt. Gesamt-RNA, die auf denaturierendem Agarosegel läuft, zeigt zwei verschiedene ribsomale Fragmente, die entweder 18S oder 28S bei eukaryotischer RNA oder 16S und 23S bei prokaryotischer RNA entsprechen, sowie Fragmente kleiner RNA-Spezies. Traditionell wurde die Intensität dieser rRNA-Banden auf denaturierenden Agarosegelen verwendet, um ein Verhältnis zu berechnen, das als Indikator der RNA-Integrität diente. Es wird von einer hohen Qualität der RNA ausgegangen, wenn das Verhältnis der eukaryotischen 28S:18S-Bandenintensität etwa 2,0 beträgt.
Abbildung 1 zeigt ein Beispiel einer Gesamt-RNA-Bewertung durch mit Ethidiumbromid gefärbter Agarose-Gelelektrophorese. Bei
Gesamt-RNA mit guter Qualität erscheinen die zwei größten rRNA als eindeutige Banden mit etwa 5 kb und 2 kb, und die obere Bande sollte etwa die doppelte Intensität der unteren Bande aufweisen. Die mRNA kann hauptsächlich zwischen den zwei rRNA-Banden als helle Schmierspur auftreten oder kaum erkennbar sein.
Abbildung 1.Beurteilung der Integrität der RNA durch Agarosegel-Analyse. Gesamt-RNA-Proben (2 µg) wurden auf einem 1%igen Agarosegel in TBE-Puffer fraktioniert und mit Ethidiumbromid gefärbt. Bahnen 1 und 2 zeigen RNA mit hoher Qualität, während Bahnen 3 und 4 zersetzte RNA zeigen.
Gelelektrophorese ist jedoch ein nicht sensitives Verfahren zum Bestimmen der Probenintegrität und erfordert hohe Konzentrationen der Probe. Bei der Arbeit mit kleinen Proben ist die Menge selten ausreichend, um eine Gelelektrophorese und außerdem alle gewünschten Experimente durchzuführen. Da dieser Ansatz auf der Interpretation von Gelabbildungen durch Menschen beruht, ist er subjektiv, kaum zwischen Laboren vergleichbar und die gewonnenen Daten können nicht digital verarbeitet werden.
Einige dieser Probleme werden durch die Analyse der Gesamt-RNA mit automatisierter Kapillarelektrophorese angegangen.
Kapillare Nukleinsäurequalitätsprüfungssysteme
Nukleinsäureproben können durch Instrumente wie den Agilent 2100 Bioanalyzer oder Bio-Rad Experion analysiert und verglichen werden. Mit diesen Systemen werden elektrophoretische Spuren verwendet, um numerische Integritätswerte oder Integritätskategorien zuzuweisen.
Diese Instrumente nutzen einen Lab-on-a-Chip-Ansatz, der die Kapillarelektrophorese mit einem Fluoreszenznachweis kombiniert. Das Elektrophoreseverfahren wird auf dem Chip ausgeführt und basiert auf den Prinzipien einer traditionellen Gelelektrophorese, die verkleinert wurde, was den Verbrauch der Probe und die Trennungsdauer verringert.
Dieser Chip umfasst Wells für Proben, Gel und einen externen Standard (Fragmentgrößenleiter). Bei der Herstellung werden Mikrokanäle in Glas erzeugt, um verbundene Netzwerke zwischen den Wells zu schaffen. Diese Mikrokanäle werden anschließen mit einem Siebpolymer und Fluoreszenzfarbstoff gefüllt. Elektroden werden in die Wells eingebracht und der Chip wird zu einem integrierten elektrischen Schaltkreis.
Geladene Biomoleküle wie DNA oder RNA werden als Reaktion auf einen Spannungsgradienten durch die Matrix getrieben. Aufgrund des konstanten Masse-Ladungs-Verhältnisses und der Gegenwart der Siebpolymermatrix werden die Moleküle basierend auf ihrer Größe getrennt, sodass kleinere Fragmente schneller wandern als größere.
Farbstoffmoleküle interkalieren in Nukleinsäurestränge, und diese Komplexe werden durch laserinduzierte Fluoreszenz nachgewiesen. Die Daten werden anschließend in elektronische gelartige Abbildungen und Elektropherogramme übersetzt.
Der Agilent 2100 Bioanalyzer wird in Verbindung mit den LabChip-Kits RNA 6000 Nano und RNA 6000 Pico eingesetzt. Diese bioanalytische Vorrichtung basiert auf einer Kombination aus mikrofluidischen Chips, spannungsinduzierter Größentrennung in mit Gel gefüllten Kanälen und laserinduziertem Fluoreszenznachweis (LIF) auf einem verkleinerten Maßstab. Zwölf Proben können nacheinander Verarbeitet werden, wobei nur sehr kleine Mengen jeder Probe verbraucht werden. Die RNA-Moleküle werden mit einem interkalierenden Farbstoff gefärbt und mittels LIF nachgewiesen. Die Daten werden automatisch archiviert und sind als Elektropherogramme, gelartige Abbildungen und im Tabellenformat verfügbar.
Der Bioanalyzer besitzt einen guten linearen Dynamikumfang und der RNA 6000 Nano-Assay kann verwendet werden, um RNA-Proben mit Konzentrationen im Bereich von 25 ng/µl bis 500 ng/µl zu analysieren. Obwohl die quantitative Untergrenze des RNA 6000 Nano-Assays als 25 ng/µl festgelegt ist, wird empfohlen, mindestens 50 ng/µl zu verwenden, um eine aussagekräftige Berechnung der RNA-Integritätsnummer (RIN) zu erhalten. Wenn geringere Konzentrationen verwendet werden, treten größere Variationen der RIN zwischen Proben auf. Der Pico-Assay kann verwendet werden, um die RNA-Integrität von Proben mit Konzentrationen im Bereich von 50 pg/µl bis 5 ng/µl zu bestimmen.
Die Agilent 2100 Bioanalyzer-Software wird eingesetzt, um den Anteil der RNA vor, zwischen und nach den rRNA-Peaks zu bewerten, um eine relative Integritätsnummer (RIN) für die RNA-Probe zu bestimmen. Intakte RNA hat eine RIN von 10, wogegen vollständig zersetzte RNA eine RIN von 1 hat. Dies erleichtert die Interpretation eines Elektropherogramms und der Vergleich von Proben wird möglich.
Teilweise zersetzte RNA (RIN <9) kann in RT-qPCR zufriedenstellende Ergebnisse liefern; dies hängt aber wahrscheinlich von den analysierten Zielen, dem erforderlichen Grad der Sensitivität und der RT-Strategie ab. Eine RT-qPCR-Strategie, die zwei Schritte mit Oligo(dT)-an-Primer-reverser-Transkription und PCR-Primern nahe dem 5‘-Ende einer langen cDNA verwendet, erfordert Proben mit deutlich höherer Integrität als eine Strategie, die eine einstufige RT-qPCR mit genspezifischen Primern einsetzt. Die Wirkung der verschiedenen RT-Strategien und ihre Toleranz gegenüber zersetzten Matrizen wird detailliert erörtert (siehe Reverse Transkription). Außerdem ist eine höhere Probenintegrität erforderlich, um ein seltenes statt ein reichlich vorkommendes mRNA-Ziel nachzuweisen. Daher sollte die Auswirkung der Matrizenzersetzung auf das Verhältnis von Zielen verschiedener Reichhaltigkeit (z. B. Test- und Referenzgene) beachtet werden. Die Korrelation zwischen RIN und dem Erfolg von RT-qPCR sollte für jeden Assay empirisch bestimmt werden. Obwohl die RIN die Bewertung der Integrität von RNA-Aufbereitungen ungemein erleichtert und es deutlich einfacher macht, Proben oder RNA-Isolationsverfahren zu vergleichen, ist es noch nicht möglich, im Voraus zu bestimmen, ob sich die RNA für ein bestimmtes Experiment eignet. Abbildung 2 zeigt die Spuren des Agilent Bioanalyzer für zwei RNA-Proben. Es wurde kein Unterschied bei der Ausbeute verschiedener seltener mRNA-Ziele in cDNA, die mit einer einstufigen RT-qPCR mit genspezifischen Primern erzeugt wurden, festgestellt. Die gleichen mRNA-Ziele wurden jedoch bis zu 2 Zyklen später nachgewiesen, was auf 4-fach weniger mRNA in der Probe mit geringerer Integrität (11, RIN = 7,0) als in der Probe mit höherer Qualität (9, RIN = 9,8) hindeutet, wenn eine zweistufige RT-qPCR mit Oligo(dT)-an-Primer in der RT verwendet wird.
Abbildung 2Elektropherogramm, das die Bewertung der RNA-Integrität durch den Agilent 2100 Bioanalyzer zeigt. Proben von Gesamt-RNA-Aufbereitung (~150 ng) wurden auf einem RNA 6000 Nanochip fraktioniert und mit dem Agilent 2100 getrennt. Die Integrität wurde beurteilt und einer RIN zugeordnet.
Die Probenqualität ist kritisch und muss daher verifiziert werden, bevor die Proben in qPCR-Assays verwendet werden. Es wurde deutlich aufgezeigt, dass die Analyse von zersetzten DNA-Proben Daten mit schlechter Qualität erzeugen kann1, auch wenn dies nicht immer der Fall ist8 und teilweise von dem RT-Protokoll (Reverse Transkription) abhängt.9
Obwohl die Kapillarsysteme eine deutliche Verbesserung gegenüber herkömmlicher Gelektrophorese darstellen, sind sie spezialisierte Ausrüstungsteile, die teuer sind und sich nicht für einen hohen Durchsatz eignen. Außerdem wurde festgestellt, dass die RIN nicht das Wundermittel der Messungen ist, das wünschenswert wäre. Abbildung 3 zeigt Proben, die einer Inkubation von 1 Minute auf nackter menschlicher Haut unterzogen wurden und unerwarteter Weise scheinbar keine Zersetzung aufwiesen, als die Gesamt-RNA mit einem Agilent Bioanalyzer analysiert wurde. Mit einem alternativen Verfahren zum Bestimmen der Zersetzung wurde erkannt, dass sie zersetzte Transkripte enthalten (siehe nachstehend).
Abbildung 3.Elektropherogramm der Gesamt-RNA (~150 ng), die durch Kapillarelektrophorese mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer getrennt wurde. Die RNA wurde vor der Analyse 1 Minute auf einer nackten menschlichen Hand inkubiert. Die Analyse-RIN von 10 gibt an, dass die RNA scheinbar eine hohe Qualität aufwies und intakt war.
Aus diesem Grund ist es wichtig, mit Vorsicht an die Interpretation der RIN und anderer automatisch generierter Messungen der Probenintegrität heranzugehen sowie eine zusätzliche, transkriptspezifische Untersuchung in Erwägung zu ziehen. Ein solcher Ansatz beruht auf der Messung eines Ziels mit zwei unabhängigen Assays. Der Integritäts-Assay beruht auf der Messung des Verhältnisses der Mengen des Ziels Richtung 5‘-Ende und am 3‘-Ende desselben Transkripts (Abbildung 4)10. Dies stellt eine relative Messung der transkriptspezifischen RNA-Integrität bereit (für ein 3‘/5‘-Assayprotokoll siehe Anhang A).
Abbildung 4.Diagramm, das einen 3‘/5‘-Integritätsassay darstellt. cDNA wird mit durch Oligo(dT) geprimter RT erzeugt. Zwei qPCR-Assays werden dazu eingerichtet, auf dasselbe Transkript abzuzielen und die Sonden werden mit verschiedenen Fluorophoren markiert, um den Multiplex-Nachweis zu ermöglichen. Falls die RNA intakt ist, sollte der Nachweis beim 5‘- und 3‘-Assay gleich sein. Falls die RNA zersetzt ist, sollte der Nachweis des 3‘-Assays relativ zum 5‘-Assay dagegen höher sein.
So wird der 3‘/5‘-Verhältnis-Assay dazu eingesetzt, die Qualität von RNA-Proben zu bewerten. Die Verwendung dieses Ansatzes wird in Abbildung 5 durch das Prüfen des Zustands des GAPDH-Transkripts (die genauen zu untersuchenden Ziele sollten in jedem Experiment getestet werden) in der RNA-Probe demonstriert, die in Abbildung 3 gezeigt wird. Nach einer mit Oligo(dT) geprimten Synthese wird das GAPDH-Transkript mit sowohl 5‘- als auch 3‘-Assay quantifiziert. Falls die RNA intakt ist, wird von einer gleichen Konzentration in jedem Assay ausgegangen (Verhältnis = 1). Falls die RNA dagegen zersetzt ist, wird für den 3‘-Assay relativ zum 5‘-Assay eine höhere Kopienzahl erwartet.
Abbildung 5. Demonstration des 3‘/5‘-Assays für die Identifizierung von zersetzten RNA-Proben. Obwohl die Analyse mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer für beide RNA-Proben eine RIN von 10 ausgab, wurde ein 3‘/5‘-Assay herangezogen, um einen 9 Cq-Verlust (etwa 1.000-fach) im 5‘-Assay der Probe nach der Inkubation auf der menschlichen Hand für 1 Minute (1‘-Zersetzung) aufzuzeigen, während der 3‘ konstant blieb.
Die Analyse der RNA mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer führte zu dem Schluss, dass die in Abbildung 3 gezeigte RNA intakt war und sowohl für die RNA nach einer 1‘-Inkubation auf der nackten menschlichen Hand als auch für dieselbe aufgereinigte Probe vor der Zersetzung eine RIN von 10 ergab. Bei Anwendung des 3‘/5‘-Assays zeigte der 3‘-Assay für beide Proben denselben Cq, während der 5‘-Assay einen Verlust von 9 Zyklen zeigt, was einen 1.000-fachen Verlust von GAPDH 5‘ und die Zersetzung des Transkripts angibt. Diese Feststellung bekräftigt die Darlegung, dass der Zustand der rRNA (eine signifikante Komponente des RIN-Algorithmus) kein verlässlicher Indikator für die Integrität der mRNA ist. Die Verlässlichkeit des 3‘/5‘-Assays als Maß der gesamten Probenqualität hängt jedoch von der Geschwindigkeit, mit der die individuellen Transkripte zersetzt werden ab.11 Um dies zu untersuchen, wurde die aus HT29-Zellen extrahierte RNA einer Zersetzung durch Inkubation für 72 h bei Raumtemperatur oder alternativ für 2 h bei 62 °C unterzogen. Die gesamte Probenqualität wurde mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer analysiert. Die Assays wurden auch für die 3‘- und 5‘-Regionen von 13 universell exprimierten Genen konzipiert. Die Quantität dieser Ziele wurde in der aufgereinigten, hochwertigen, nicht zersetzten RNA-Probe (HT29) mit beiden Assays für jedes Gen bestimmt (Abbildung 6A).
Abbildung 6A.Bestimmung der RNA-Qualität mit einem 3‘/5‘-Assay a) RNA-Proben aus HT29-Zellen mit einer RIN von etwa 10 wurden mit Oligo(dT) revers transkribiert und das 3‘/5‘-Verhältnis (y-Achse) wurde für alle 13 Gene (x-Achse) bestimmt. Es gibt eine allgemeine 3‘-Verzerrung bei der Quantifizierung, wenn beide Assays für dasselbe Ziel verwendet werden und die RNA hochwertig ist. Der Grad der Verzerrung unterscheidet sich zwischen den Genen und beeinflusst so die Bestimmung der Verhältnisse von Genen, zum Beispiel bei der Normalisierung auf ein Referenzgen. (Die Daten wurden freundlicherweise von Prof. Stephen Bustin, Vereinigtes Königreich, zur Verfügung gestellt.)
Abbildung 6B.RNA-Proben aus HT29-Zellen mit einer RIN von etwa 7 wurden mit Oligo(dT) revers transkribiert und das 3‘/5‘-Verhältnis (y-Achse) wurde für alle 13 Gene (x-Achse) bestimmt. Es gibt eine starke 3‘-Verzerrung bei der Quantifizierung, wenn beide Assays für dasselbe Ziel verwendet werden und die RNA hochwertig ist sowie eine deutliche 3‘-Verschiebung des Verhältnisses, wie in Abbildung 6A gezeigt. Der Verschiebungsgrad unterscheidet sich signifikant zwischen Genen, was darauf hindeutet, dass unterschiedliche Gene mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten zersetzt werden. (Die Daten wurden freundlicherweise von Prof. Stephen Bustin, Vereinigtes Königreich, zur Verfügung gestellt.)
Abbildung 6C.RNA-Proben aus HT29-Zellen mit einer RIN von etwa 5 wurden mit Oligo(dT) revers transkribiert und das 3‘/5‘-Verhältnis (y-Achse) wurde für alle 13 Gene (x-Achse) bestimmt. Die Daten für Wiederholungen unterscheiden sich stark. (Die Daten wurden freundlicherweise von Prof. Stephen Bustin, Vereinigtes Königreich, zur Verfügung gestellt.)
Wenn RNA mit hoher Qualität verwendet wird, liegen die Daten für Wiederholungen nah beieinander, aber bei den meisten Genen ist eine klare Verzerrung des Assays, in der Regel zum 3‘-Ende, von bis zu 10-fach erkennbar. Bei UBC wurde sogar eine 100-fache Verzerrung festgestellt. Dies kann die Zersetzung oder Differenzerfassung durch die Assays aufgrund von Matrizenfaltung oder anderen RT-PCR-beeinflussenden Faktoren widerspiegeln. Einige Ziele scheinen beim Nachweis eine 5‘-Verzerrung aufzuweisen, was aufgrund von Unterschieden bei der Assay-Effizienz oder anderen Komponenten des RT-qPCR-Assays auftreten kann. Die Assays wurden anschließend verwendet, um dieselben Ziele mit cDNA aus RNA mit einer RIN von 7,3 und 5,3 (Abbildung 6B bzw. 6C) zu quantifizieren. Es gab klare Anzeichen für die Zersetzung, wenn RNA-Proben mit moderater Zersetzung (RIN 7) verwendet wurden, wobei die meisten Gene eine 10- bis 1.000-fache 3‘-Verschiebung aufweisen, was auf eine Zersetzung dieser Transkripte zwischen dem 3‘- und dem 5‘-Assay hindeutet. Interessanterweise zeigten drei Gene eine 5‘-Verschiebung, was darauf hindeuten könnte, dass die Zersetzung zu einer Konformationsänderung führte und die RT oder 5‘-qPCR effizienter machte. Da die Änderungen für jedes Gen unterschiedlich sind, wird deutlich, dass das Verhältnis von Genen, die mit RIN-9-RNA gemessen werden, sich signifikant von denen unterscheidet, die mit RIN-7-RNA gemessen werden. Wenn RNA mit einer RIN von 5 verwendet wird, besteht ein höherer Grad der Variabilität und das 3‘/5‘-Verhältnis für jedes Gen beträgt im Mittel etwa 1. Da auch von hochwertiger intakter RNA ein Durchschnitt von 3‘/5‘ = 1 erwartet wird, steht fest, dass dieses System für die Integritätsbestimmung von RNA-Proben mit moderater bis augenscheinlich keiner Zersetzung anwendbar ist und eine Verbesserung darstellt, wenn es zusätzlich zu Gel- oder Kapillarelektrophorese eingesetzt wird.
Die Feststellung der 5‘-Verzerrung in den Assays war faszinierend. Theoretisch sollte es für Assays mit identischer Effizienz nicht möglich sein, mehr 5‘-Amplicon als 3‘-Amplicon zu erzeugen. Offensichtlich beeinflussen zusätzliche Faktoren die Differenzierungsleistung dieser Assays. Eine weitere Überlegung zur Probenqualität ist das Vorhandensein von Verunreinigung, die die RT- oder qPCR-Leistung hemmen oder sogar verbessern können, und ob diese Genziel-spezifisch sind.
Kontamination
Im Zusammenhang mit PCR-Assays sind die signifikanten Kontaminationsformen eine Nukleinsäurenmatrix, die unpassend in der Probe vorkommt und die neben dem spezifischen Ziel auch nachgewiesen werden kann, was zu einem falsch-positiven Ergebnis führt, oder ein Material, das die Downstream-Reaktionen hemmt, was zu falsch-negativen Ergebnissen oder geringeren Schätzungen der Matrizenkonzentration führt.
Matrizen-Kontamination
PCR-Assays sind besonders anfällig für eine Amplicon-Kontamination mit der spezifischen Zielsequenz von Interesse, da der PCR-Prozess exponentiell Kopien des Amplicons erzeugt. Folglich erzeugt der Prozess des Durchführens eines PCR-Assays die perfekte Verunreinigung für künftige PCR-Assays. In einem molekularbiologischen Labor ist es essenziell, den Bereich, in dem die Reaktion eingerichtet und durchgeführt wird von dem Bereich für die Post-PCR-Analyse zu trennen, in dem das PCR-Produkt analysiert und weiter manipuliert wird. Vorzugsweise sollten, wo möglich, zwei getrennte Räume mit fest zugeordneter Ausrüstung und Laborkitteln verwendet werden, sodass nichts aus dem Bereich für die Post-PCR-Analyse jemals mit dem reinen (Vor-PCR-)Bereich in Kontakt kommt. Viele Labore implementieren außerdem weitere Kontrollen für den Personalzugang zu diesen Bereichen, um eine Reaktionsübertragung zu verhindern. Quantitative PCR-Assays sind besonders anfällig für Amplicon-Kontaminationen, da sie ein einzelnes Matrixmolekül nachweisen können und die kontaminierende Matrix die Quantitätsmessungen verfälscht.
Zusätzlich zur Erzeugung des spezifischen Amplicons durch PCR ist bei der Einrichtung im Labor Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass das ursprüngliche Matrixmaterial nicht von einer Probe in eine weitere übertragen wird (Kreuzkontamination) oder, im Falle einer Analyse von Humanproben, dass kein Material von dem Personal, das die Analyse durchführt, eingebracht wird.
Das Übernehmen eines standardmäßigen experimentellen Verfahrens mit geeigneten Kontrollen zum Identifizieren potenzieller Kontaminationsquellen wird wärmstens empfohlen.
Kontamination von RNA mit gDNA
Bei der Analyse von RNA ist es wichtig sicherzustellen, dass keine Kontamination mit gDNA vorliegt. Die enzymatische Behandlung von Proben mit DNase I in Lösung wird zum Entfernen von kontaminierender gDNA empfohlen und ist besonders wichtig für Untersuchungen von Intron-losen Genen oder wenn das Assay-Design nicht zwischen gDNA- und cDNA-Sequenzen unterscheidet. Wo immer es möglich ist, ist es ratsam, Assays über die Intron-/Exon-Grenze zu entwickeln, sodass nur die verarbeiteten mRNA-Sequenzen amplifiziert und/oder nachgewiesen werden können. Dies verhindert eine Amplifikation von gDNA nicht immer, da es Sequenzen gibt, die als verarbeitete Pseudo-Gene existieren, die im Wesentlichen genomische cDNA-Sequenzen sind (siehe PCR/qPCR/dPCR-Assay-Design). Es sollte auch bedacht werden, dass DNA in den Reagenzien vorliegt und potenziell zu Kontaminationsproblemen führen kann.12
Hemmung
Das Vorhandensein von Inhibitoren beeinflusst qPCR-Assays für verschiedene Ziele unterschiedlich.13 Daher kann das Vorhandensein von Inhibitoren in einer Probe zu komplexen Störungen der wahren Daten führen. Da jeder Assay unterschiedlich beeinflusst wird, könnten die resultierenden Verhältnisse der Quantität des Gens von Interesse (GOI) zu der des Referenzgens nicht die tatsächliche Menge jedes Gens widerspiegeln, was zu falschen Schätzungen der relativen Zielmenge oder Schwierigkeiten beim Interpretieren von Genotypisierungs-Assays führt.
PCR-Inhibitoren, die während des Experiments häufig eingebracht werden sind unter anderem: Tris, Ethanol, Isopropanol, EDTA, das reverse Transkriptase-Enzym, Guanidinisothiocyanat und Phenol.
Ein System, das zum Nachweis von Inhibitoren verwendet werden kann ist der SPUD-Assay14 (Abbildung 7). Mit diesem Verfahren wird ein künstliches Amplicon (aus einer Kartoffelnukleinsäuresequenz ohne Homologie zu einer anderen bekannten Sequenz gewonnen) in Gegenwart von Wasser (Amplifikationskontrolle; Abbildung 7, Probe a) oder der Testprobe (Abbildung 7, Proben b und c) einer qPCR unterzogen. Falls die Testprobe keinen Inhibitor des SPUD-Assays enthält, ist der aufgezeichnete Quantifizierungszyklus (Cq) für die Amplifikationskontrolle und die Testprobe gleich. Falls die Testprobe jedoch einen Inhibitor enthält, ist der Cq erhöht (ein detailliertes Protokoll für den Test wird als SPUD-Protokoll, Anhang A bereitgestellt).
Abbildung 7.7.Darstellung des SPUD-Assays. In diesem Fall zeigt die Differenz des Cq zwischen der Probe c und der Kontrollprobe a das Vorhandensein eines Inhibitors.
Ein ganzheitliches Beispiel: Analyse der RNA-Probenqualität
Jedes der vorstehend beschriebenen Probenqualitätssicherungsverfahren wird zum Bestimmen eines bestimmten Merkmals der Probe eingesetzt. Dieser Abschnitt enthält eine Beschreibung eines beispielhaften Arbeitsablaufs, der auf die Proben angewandt werden kann, mit einer Beschreibung der Daten, die jede Qualitätssicherungsprüfung bereitstellt. Die vorgestellte Untersuchung ist weder umfassend noch wird sie als definitive Standardvorgehensweise bereitgestellt; sie wird lediglich als Beispiel eines möglichen Qualitätssicherungsverfahrens bereitgestellt.
Fünf RNA-Proben wurden hergestellt und der Reihe nach als A bis E markiert. Diese Proben wurden mit dem NanoDrop analysiert und wiesen eine sehr ähnliche Konzentration (etwa 100 ng/µl) auf. Das Verhältnis von A260/A280 wurde zweimal mit zwei unabhängigen Messungen für jede Probe aufgezeichnet (Abbildung 8) und liegt in allen Fällen bei etwa 1,9. Dies deutet auf eine hohe Qualität der Probe ohne Verunreinigungen hin, die bei A280 nm nachgewiesen werden würden. Es ist anzumerken, dass die Messung bei A230 nm in dieser Analyse fehlt. Eine Analyse mittels Kapillarelektrophorese (der Agilent 2100 Bioanalyzer) zeigt ein anderes Bild (Abbildung 9). Proben A und B weisen eine hohe Qualität auf (RIN 10 und Konzentration 110 ng/µl in Übereinstimmung mit der NanoDrop-Messung), Probe C ist stark zersetzt (RIN 2,4, Konzentration 62 ng/µl – die Hälfte der Konzentrationsbestimmung des NanoDrop) und Proben D und E weisen eine hohe Qualität auf (RIN 9,1 bzw. 9,5), haben jedoch eine geringere Konzentration als Proben A und B (30 ng/µl bzw. 43 ng/µl). Die Informationen der zwei Messverfahren ergänzen sich teilweise, da der NanoDrop keinen Zersetzungsgrad angibt. Sie stehen jedoch auch in Widerspruch zueinander, da sich die Konzentrationen von Proben D und E stark unterscheiden. Dies wäre ein Grund zur Sorge und sollte zu weiteren Untersuchungen führen. Die Kapillarelektrophorese ist ein leistungsstarkes Instrument zur Probenbewertung; sie hat jedoch einen relativ geringen Durchsatz und steht nicht allen Forschenden zur Verfügung. Eine alternative Prüfung für die Probenintegrität ist die 3‘/5‘-Analyse. Diese Prüfung wurde bei Proben A–E mit gleichen Konzentrationen gemäß der NanoDrop-Messung durchgeführt. Beim Prüfen dieser Proben mit diesem Ansatz wurde deutlich, dass die RNA aus Proben A (Abbildung 10A) und B (Daten nicht veranschaulicht, identisch zu Probe A) intakt war, wogegen Probe C stark zersetzt war (Abbildung 10B). Es ist zu beachten, dass sich der Cq für Probe C sowohl im 5‘-Assay als auch im 3‘-Assay signifikant zu höheren Werten verschob, was einen Verlust des spezifischen Ziels relativ zu Proben A und B angibt. Das Profil für Proben D und E entsprach nicht den Erwartungen (Abbildung 10C zeigt Probe D, für Probe E werden keine Daten veranschaulicht, sie ähnelt jedoch Probe D), da der 5‘-Assay einen geringeren Cq aufweist als der 3‘-Assay, was angibt, dass in einer durch Primen mit Oligo(dT) hergestellten cDNA-Probe mehr 5‘-Signal als 3‘-Signal auftritt. Die alternative Erklärung ist, dass diese Proben einen Inhibitor enthalten, der den 3‘-Assay stärker beeinträchtigt als den 5‘-Assay. Um diese Theorie zu prüfen, wurde der SPUD-Assay mit allen Proben durchgeführt (Abbildung 11). In Proben A bis C gab es keinen Hinweis auf einen Inhibitor. Proben D und E wiesen im SPUD-Assay eine Hemmung auf, wobei der Assay bei Probe D komplett versagte.
Mit all diesen Informationen kann geschlussfolgert werden, dass in jeder Probe eine gleiche Konzentration Nukleinsäurenmaterial vorkam (NanoDrop) und die Proben nicht nachweisbare Verunreinigung enthielten, die bei 280 nm absorbieren (Protein) (andere Wellenlängen wurden nicht geprüft). Proben A und B wiesen eine hohe Integrität ohne nachgewiesene Inhibitoren auf, Probe C war stark zersetzt (Kapillarelektrophorese und 3‘/5‘-Assay), ohne nachgewiesene Inhibitoren, und Proben D und E waren intakt, enthielten jedoch PCR-Inhibitoren (3‘/5‘-Assay und SPUD).
Abbildung 8.NanoDrop-Qualitätsprüfung (A260/A280).
Abbildung 9.Analyse der RNA-Proben A–E mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer.
Abbildung 10A.GAPDH 3’/5’-Multiplex-Assay RNA-Probe.
Abbildung 10B.GAPDH 3’/5’-Multiplex-Assay Probe C.
Abbildung 10C.GAPDH 3’/5’-Multiplex-Assay Probe D.
Abbildung 11.SPUD-Analyse der Proben A–E.
Literatur
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