Auswirkungen der GenElute™-E Aufreinigungsmethode auf die Genauigkeit der DNA-Quantifizierung und nachgeschaltete enzymatische Prozesse

• DNA-Extraktions- und Aufreinigungsmethoden
• Bewertung von Verunreinigungen, die bei der Nukleinsäurevorbereitung eingeführt werden
  • Interferenz mit der Quantifizierung durch Ultraviolett (UV)-Spektralphotometrie
  • Gescherte DNA und Verunreinigungen von Nukleinsäuren mit niedrigem Molekulargewicht, bewertet durch Gelelektrophorese
  • Interferenz in der qPCR
• Schlussfolgerungen

Bei der klassischen DNA- und RNA-Aufreinigung auf der Basis von Spinsäulen werden Kieselgel-Membransäulen zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen, Gewebe, Blut und anderen Probenarten verwendet. Die DNA oder RNA wird mit hohen Konzentrationen eines chaotropen Salzes wie Guanidinhydrochlorid an das Kieselgel gebunden. Nach der Nukleinsäurebindung wird die Kieselgelsäule mit einer Salz/Ethanol-Lösung gewaschen, um andere Biomoleküle aus der Probe zu entfernen. Abschließend wird dann die aufgereinigte DNA oder RNA mit Tris-Elutionspuffer oder Wasser von der Säule eluiert.

Solche Binde-Wasch-Eluier-Verfahren sind mühsam und erfordern mehrere Wasch- und Schleudervorgänge (Spins). Wiederholte Schleudervorgänge können zu einer erheblichen Scherung der DNA führen. Außerdem können chaotrope Salze und andere Verunreinigungen leicht in die eluierte DNA oder RNA übergehen und die finale Reinheit und Quantifizierung sowie nachgeschaltete enzymatische Prozesse wie die PCR beeinträchtigen.

Wir haben ein neuartiges Einzel-Spin Aufreinigungssystem für Nukleinsäure evaluiert, durch das die Notwendigkeit von hohen Salzbindungen und Ethanol-Waschschritten eliminiert wird. In GenElute™-E Kits für die DNA- und RNA-Aufreinigung wird ein Negativ-Chromatographieverfahren eingesetzt, das auf Größenausschluss beruht, um große DNA- und RNA-Nukleinsäuremoleküle von kleineren Protein-, Lipid- und ionischen Bestandteilen in Zellen, Gewebe, Blut und anderen Proben zu trennen (Abbildungen 1-2).

Abbildung 1. Aufreinigung von Nukleinsäuren durch Negativ-Chromatographieverfahren (Größenausschluss).

Abbildung 2. Elution von aufgereinigter DNA und Rückhaltung von Proteinen, Lipiden und anderen Molekülen bei Einsatz des GenElute™-E Einzel-Spin-Kits für DNA aus Blut, hohe Ausbeute, mit Blutproben der Maus. A) Absorptionsspektren von aufgereinigter genomischer DNA (rote Linie). B) Absorptionsspektren des Retentats der GenElute™-E Spin-Säule (schwarze Linie), überlagert auf Spektren der aufgereinigten DNA (rot). Retentatspektren weisen Proteine und andere Verunreinigungen mit OD bei ~280 nm oder ≤ 240 nm auf. Beachten Sie die Änderung der Skala auf der y-Achse.

Wir bewerteten die Auswirkungen des Nukleinsäure-Aufreinigungsverfahrens auf Verunreinigungen, welche die Quantifizierung und nachgeschaltete enzymatische Prozesse beeinträchtigen. Für diese Vergleichsstudien wurde genomische DNA mit der GenElute™-E Einzel-Spin-Aufreinigungstechnologie oder der klassischen Kieselgel-basierten Binde-Wasch-Eluier-Spin-Prep-Technologie von Anbieter X aufbereitet. Die Reinheit der Nukleinsäure wurde anhand von drei Verfahren bewertet:

• UV-Spektralphotometrie (Verhältnis der optischen Dichte, gemessen bei A_260nm/_280nm und A_260nm/_230nm)
• Gelelektrophorese
• Quantitative PCR (qPCR)

Die Ergebnisse zeigen, dass GenElute™-E Einzel-Spin DNA- und RNA-Aufreinigungssysteme eine höhere Reinheit bieten als aktuelle Kieselgel-Spin-Prep-Techniken, was zu einer genaueren Quantifizierung und einer geringeren Interferenz durch Verunreinigungen in nachgeschalteten enzymatischen Prozessen wie der PCR führt.

Bewertung von Verunreinigungen, die bei der Nukleinsäurevorbereitung eingeführt werden

Interferenz mit der Quantifizierung durch Ultraviolett (UV)-Spektralphotometrie

Übliche biologische Verunreinigungen wie Proteine, fragmentierte Nukleinsäuren, ssDNA, RNA (bei DNA-Messungen), Primer und chaotrope Salze aus Extraktions- und Aufreinigungsprotokollen können zu einer Überschätzung der Nukleinsäurekonzentration führen. Einige dieser Verunreinigungen können mit Hilfe der Ultraviolett-Spektralphotometrie (UV) gemessen werden. In diesem Verfahren wird UV-Licht durch die aufgereinigte DNA- oder RNA-Probe geleitet. Die Extinktion der Probe wird bei verschiedenen Wellenlängen gemessen.

Die Extinktion bei 260 nm (A₂₆₀) wird zur Messung der Nukleinsäure verwendet. Die Extinktion bei 280 nm (A₂₈₀) wird verwendet, um kontaminierendes Protein in der Probe zu messen. Das Verhältnis zwischen A₂₆₀/_A280 kann zur Abschätzung der Probenreinheit in Bezug auf Proteinverunreinigungen eingesetzt werden. Hochreine DNA weist ein A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnis ≥ 1,8 auf. Ein niedrigeres Verhältnis deutet auf eine Proteinkontamination im finalen Präparat hin.

Die Extinktion bei 230 nm (A₂₃₀) kann verwendet werden, um das Vorhandensein chemischer Verunreinigungen wie chaotropher Salze festzustellen. Das Verhältnis A₂₆₀/A₂₃₀ soll idealerweise größer als 2,0 sein, um die chemische Interferenz in enzymatischen Prozessen wie der PCR zu minimieren. Die Beurteilung dieses Verhältnisses ist von entscheidender Bedeutung, wenn hochreine Proben benötigt werden.

Das Extinktionsspektrum, das A₂₆₀/₂₈₀-Verhältnis und das A₂₆₀/₂₃₀-Verhältnis wurden für GenElute™-E Einzel-Spin-DNA- und -RNA-Aufreinigungssysteme unter Einsatz von Blutproben bewertet. Die Ergebnisse wurden mit denen verglichen, die bei der Kieselgel-Spin-Prep-Aufreinigung der gleichen Proben mit einem Konkurrenzprodukt erzielt wurden (Abbildung 3 und Tabelle 1). Die Daten deuten darauf hin, dass GenElute™-E Aufreinigungssysteme eine höhere Reinheit der genomischen DNA mit weniger biologischen und chemischen Verunreinigungen in der finalen Probenvorbereitung im Vergleich zu Kieselgel-Binde-Wasch-Eluier-Herstellungsverfahren bieten.

Abbildung 3. UV-Absorptionsspektren genomischer DNA, die aus Blut unter Verwendung von A) Kieselgel-basierten Spin-Prep-Kits zur Aufreinigung von DNA von Anbieter X oder B) GenElute™-E Einzel-Spin Negativ-Chromatographie-DNA-Aufreinigungskits hergestellt wurde. Eingesetztes Diagramm, gemessen bei 10facher Konzentration der eluierten Fraktion. Verunreinigungen werden ausschließlich in den Kieselgel-Elutionsfraktionen nachgewiesen. Die schwarzen Linien zeigen die Spektren einer nach der angegebenen Methode aufgereinigten Probe auf, die durch den Prozess verunreinigt wurde. Die roten Linien sind Spektren für die aufgereinigte Probe ohne Prozessverunreinigungen, die als Basislinienkontrollen verwendet werden. Die orangefarbenen Linien sind Spektren für die Aufreinigungsmethode ohne Verwendung einer tatsächlichen Probe, durch die der Einfluss von Prozessverunreinigungen auf die spektralphotometrische Messung dargestellt wird.

Tabelle 1. Berechnetes A260/280- und A260/230-Verhältnis für DNA, die mit Hilfe von Kieselgel- und Negativ-Chromatographieverfahren (Größenausschluss) aufgereinigt wurde. Die Daten deuten darauf hin, dass die Negativ-Chromatographie mit GenElute™-E Einzel-Spin Aufreinigungskits eine bessere Reinheit mit weniger biologischen und chemischen Verunreinigungen im finalen Präparat ergab.

Probenart	Aufreinigungsmethode	A260/280 (optimaler Bereich 1,8-2,0)	A260/230 (optimaler Bereich 2,0-2,2)
Menschliches Blut	Spin-Prep-Kit auf Kieselgelbasis (Lieferant X)	2,45	0,57
	GenElute™ E Negativ-Chromatographie (Größenausschluss)	1,83	2,20

Gescherte DNA und Verunreinigungen von Nukleinsäuren mit niedrigem Molekulargewicht, bewertet durch Gelelektrophorese

Die Größentrennung durch Gelelektrophorese ermöglicht eine visuelle und quantitative Bewertung der Probenreinheit. Größere genomische DNA wandert langsamer als kleinere DNA- und RNA-Fragmente. Die resultierenden Banden können mit einem Fluoreszenzfarbstoff beobachtet oder quantifiziert werden.

Aufgereinigte DNA-Proben, die mit Hilfe von Kieselgel-basierten Spin-Prep-Kits (Lieferant X) oder Negativ-Chromatographie durch Größenausschluss (GenElute™-E Einzel-Spin DNA-Aufreinigungskits) aus Lebergewebe der Maus hergestellt wurden, wurden auf einem Agarosegel getrennt. SYBR Green wurde als Nukleinsäurefärbung verwendet. Um die Ergebnisse zu normalisieren, wurde die gleiche DNA-Masse aus jeder aufgereinigten Probe in jede Gelbahn geladen. Durch die Visualisierung des Agarosegels auf einem Transilluminator wurde deutlich, dass mit der Negativ-Chromatographie (Größenausschluss) dunklere, einzelne Banden genomischer DNA erzielt wurden als mit der Aufeinigungsmethode auf Kieselgelbasis (Abbildung 4).

Proben, die von Kieselgelmembran-Spinsäulen eluiert wurden, zeigten schwächere Banden am unteren Ende des Gels, was auf kontaminierte kleine RNA oder gescherte DNA-Moleküle in der finalen Präparation hindeutet. Da die Gelbeladung gegen die DNA in der Probe normalisiert wurde (bestimmt durch die Extinktion bei 260 nm), deuten diese Daten darauf hin, dass die Ausbeute an genomischer DNA durch dieses Verfahren überschätzt wird, da kontaminierende kleinere Nukleinsäuremoleküle ebenfalls zur Extinktionsmessung beitragen. Die höhere Intensität der einzelnen DNA-Bande, die mit der GenElute™-E Negativ-Chromatographie (Größenausschluss)-Methode erzielt wurde, lässt auf eine größere Reinheit der genomischen DNA aus diesen Gewebeproben schließen. Die Ergebnisse wurden in fluorometrischen Verfahren quantifiziert (Abbildung 5).

Abbildung 4. Gelelektrophorese aufgereinigter genomischer DNA aus Lebergewebeproben der Maus. Mausgewebe wurde mit Hilfe von Spin-Prep-Verfahren auf Kieselgelbasis (Lieferant X) oder Negativ-Chromatographie durch Größenausschluss (GenElute™-E Einzel-Spin DNA-Aufreinigungskits) aufgereinigt. Die Proben wurden so eingestellt, dass jede Agarosegelbahn mit der gleichen DNA-Menge beladen wurde. Die Ergebnisse deuten auf das Vorhandensein von verunreinigender RNA oder gescherter DNA in den Proben hin, die im Kieselgel-basierten Verfahren aufgereinigt wurden.

Abbildung 5. Berechnete Ausbeute genomischer DNA (gDNA) und Mengen kontaminierender RNA oder gescherter DNA aus Lebergewebeproben der Maus. Die Proben wurden mit Spin-Prep-Methoden auf Kieselgelbasis (Lieferant X) oder mit Negativ-Chromatographie durch Größenausschluss (GenElute™-E Einzel-Spin DNA-Aufreinigungskits) aufgereinigt. Die DNA-Mengen wurden durch Quantifizierung des Fluoreszenzsignals der SYBR Green-Färbung berechnet. Die Ergebnisse wiesen geringe, aber signifikante Mengen RNA- oder gescherter DNA-Verunreinigungen in den Proben auf, die mit Kieselgel-basierten Aufreinigungs-Spin-Säulen hergestellt wurden.

Interferenz in der qPCR

Bei Aufreinigungsverfahren auf Kieselgelbasis werden denaturierende Salze und organische Lösungsmittel wie Ethanol in die aufzureinigende Probe eingebracht. Diese Verunreinigungen können leicht auf nachgeschaltete Anwendungen übertragen werden und zu einer Hemmung enzymatischer Reaktionen führen. Durch die Beseitigung derartiger Verunreinigungen können enzymatische Verfahren wie die qPCR empfindlicher und robuster werden.

Um das Vorhandensein von Verunreinigungen, die enzymatische Prozesse hemmen, zu bewerten, wurde genomische DNA aus Nierenproben der Maus mit allen Spin-Aufreinigungsmethoden aufgereinigt. Die finalen Proben wurden in qPCR-Analyseversuchen eingesetzt (Abbildung 6). Das Beta-Aktin entsprechende Gen wurde ebenfalls als endogene Kontrolle amplifiziert. Die Daten zeigen, dass die Amplifikationskurven bei mit Kieselgel aufgereinigten Proben im Vergleich zu Proben, die mit der GenElute™-E Negativ-Chromatographie (Größenausschluss)-Aufreinigungsmethode hergestellt wurden, nach rechts verschoben waren. Dies deutet auf das Vorhandensein störender Verunreinigungen oder eine geringere als die berechnete Ausbeute in den mit Kieselgel aufgereinigten Proben hin.

Abbildung 6. qPCR-Analyse zur Bestimmung störender Verunreinigungen in genomischen DNA-Präparaten. A) Amplifikationskurven für genomische DNA aus Nierengewebe der Maus unter Verwendung eines Spin-Prep-Kits auf Kieselgelbasis von Anbieter X (blaue Kurven) und eines GenElute™-E Negativ-Chromatographie (Größenausschluss) Spin-Prep-Kits (orangefarbene Kurven). Die Kurven für die mit Kieselgel aufgereinigten Proben sind im Vergleich zu den mit GenElute™-E aufgereinigten Proben nach rechts verschoben, was auf das Vorhandensein störender Verunreinigungen oder eine Überschätzung der Ausgangskonzentration in den Kieselgelvorbereitungen schließen lässt. B) Cq-Berechnungen unter Verwendung des β-Actin-Gens als endogene Kontrollreferenz.

Schlussfolgerungen

GenElute™-E Einzel-Spin DNA- und RNA-Aufreinigungskits bieten ein komfortables Negativ-Chromatographieverfahren für die Nukleinsäureaufreinigung auf der Grundlage von Größenausschluss. Diese Kits stellen eine Alternative zu den traditionellen Spin-Preps auf Kieselgelbasis dar und bieten eine verbesserte Reinheit, die durch UV-Spektralphotometrie, Gelelektrophorese und qPCR nachgewiesen wurde.