S7101
Kit de apoptose in situ ApopTag Plus Peroxidase
The ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit detects apoptotic cells by labeling & detecting DNA strand breaks by the indirect TUNEL method.
Sinônimo(s):
Kit de detecção de apoptose in situ
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About This Item
Código UNSPSC:
12161503
eCl@ss:
32161000
NACRES:
NA.84
Preço e disponibilidade não estão disponíveis no momento.
Produtos recomendados
Nível de qualidade
fabricante/nome comercial
ApopTag
Chemicon®
método de detecção
colorimetric
Condições de expedição
dry ice
Descrição geral
O kit de detecção de apoptose in situ de peroxidase ApopTag Plus detecta as células apoptóticas por marcação e detecção de rupturas nas fitas de DNA pelo método de TUNEL indireto. O kit fornece reagentes suficientes para coloração por imunoperoxidase de 40 amostras, e inclui as lâminas de controle positivo ApopTag(R), tampão DAB e substrato. Os resultados são visualizados usando microscopia de campo claro.
Os kits de peroxidase ApopTag foram qualificados para uso em coloração histoquímica e citoquímica das seguintes amostras: tecidos fixados em formalina, embebidos em parafina, cortes de criostato, suspensões celulares, citospinas e culturas celulares. Foram desenvolvidos métodos de montagem total (34, 45). (Vide referências na ficha de dados da Sec. V.).
A especificidade de coloração dos kits de peroxidase ApopTag foi demonstrada pela Chemicon e muitos outros laboratórios. A Chemicon testou muitos tipos de sistemas de células e tecidos modelo, incluindo: (a) próstata humana, timo e intestino grosso (dados internos); (b) próstata ventral de rato pós-castração (21), (c) linfócitos de timo de rato tratados in vitro com dexametasona (3, 13), (d) membros de embriões de camundongos com 14 dias (1) e (e) glândula mamária de rato em regressão após o desmame (36). Nos modelos de timócito e próstata, usou-se eletroforese em gel de agarose para avaliar a quantidade de "padrão em escada" de DNA formado, que atingiu o pico coincidentemente com a porcentagem máxima de células coradas. Várias publicações em periódicos científicos de laboratórios em todo o mundo estabeleceram a utilidade dos kits ApopTag. (Vide referências na ficha de dados da Sec. V. Referências, publicações que citam os kits ApopTag).
Os kits de peroxidase ApopTag foram qualificados para uso em coloração histoquímica e citoquímica das seguintes amostras: tecidos fixados em formalina, embebidos em parafina, cortes de criostato, suspensões celulares, citospinas e culturas celulares. Foram desenvolvidos métodos de montagem total (34, 45). (Vide referências na ficha de dados da Sec. V.).
A especificidade de coloração dos kits de peroxidase ApopTag foi demonstrada pela Chemicon e muitos outros laboratórios. A Chemicon testou muitos tipos de sistemas de células e tecidos modelo, incluindo: (a) próstata humana, timo e intestino grosso (dados internos); (b) próstata ventral de rato pós-castração (21), (c) linfócitos de timo de rato tratados in vitro com dexametasona (3, 13), (d) membros de embriões de camundongos com 14 dias (1) e (e) glândula mamária de rato em regressão após o desmame (36). Nos modelos de timócito e próstata, usou-se eletroforese em gel de agarose para avaliar a quantidade de "padrão em escada" de DNA formado, que atingiu o pico coincidentemente com a porcentagem máxima de células coradas. Várias publicações em periódicos científicos de laboratórios em todo o mundo estabeleceram a utilidade dos kits ApopTag. (Vide referências na ficha de dados da Sec. V. Referências, publicações que citam os kits ApopTag).
Aplicação
INTRODUÇÃO
Os kits de detecção de apoptose in situ ApopTag marcam as células apoptóticas em amostras de pesquisa modificando fragmentos de DNA com desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) para detecção de células apoptóticas por coloração específica.
Este manual contém informações e protocolos para o kit de detecção de apoptose in situ ApopTag.
Princípios do procedimento
Os reagentes fornecidos nos kits de peroxidase ApopTag são projetados para marcar as terminações 3′OH livres do DNA in situ com nucleotídeos quimicamente marcados e não marcados. Os nucleotídeos contidos no tampão de reação são adicionados enzimaticamente ao DNA por desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) (13, 31). A TdT catalisa uma adição independente de molde de trifosfatos de nucleotídeos às extremidades 3′-OH de DNA dupla-fita e fita simples. Os nucleotídeos incorporados formam um oligômero composto de nucleotídeo conjugado com digoxigenina e nucleotídeo não marcado em uma sequência aleatória. A proporção de nucleotídeos marcados para não marcados nos kits de peroxidase ApopTag é otimizada para promover a ligação de anticorpos antidigoxigenina. O comprimento exato do oligômero adicionado não foi medido.
Permite-se, então, que os fragmentos de DNA que foram marcados com o nucleotídeo com digoxigenina se liguem a um anticorpo antidigoxigenina que é conjugado a uma molécula repórter de peroxidase (figura 1A). O conjugado de anticorpo ligado à peroxidase cora enzimaticamente de forma permanente, intensa e localizada substratos cromogênicos, proporcionando detecção sensível em imuno-histoquímica ou imunocitoquímica (ou seja, em tecidos ou células). Esse sistema biológico-histoquímico molecular misto possibilita uma coloração sensível e específica de concentrações muito altas das extremidades 3′-OH localizadas em corpos apoptóticos.
O sistema ApopTag difere significativamente do que foi descrito anteriormente nas técnicas de marcação in situ para apoptose (13, 16, 38, 46), nas quais a ligação da avidina à biotina celular pode ser uma fonte de erro. Verificou-se que o sistema digoxigenina/antidigoxigenina é igualmente sensível aos sistemas de avidina/biotina (22). A única fonte natural de digoxigenina é a planta digitalis. Ligantes imunoquimicamente semelhantes para a ligação do anticorpo antidigoxigenina são, de modo geral, insignificantes em tecidos animais, garantindo baixa coloração de fundo. O anticorpo policlonal de ovelha purificado por afinidade é o reagente antidigoxigenina específico usado nos kits ApopTag. Esse anticorpo exibe <1% de reatividade cruzada com os principais esteroides de vertebrados. Além disso, a porção Fc desse anticorpo foi removida por digestão proteolítica para eliminar qualquer adsorção não específica a receptores celulares Fc.
Resultados usando os kits ApopTag foram amplamente publicados (vide a seção V. Referências, publicações que citam os kits ApopTag). A linha de produtos ApopTag oferece várias opções para o design de experimentos. Um pesquisador pode optar por detectar coloração por microscopia de campo claro ou de fluorescência ou por citometria de fluxo, dependendo das habilidades técnicas e do equipamento disponíveis. Há também oportunidades para estudar outras proteínas de interesse no contexto de apoptose com os kits ApopTag. Usando anticorpos conjugados com uma enzima diferente da peroxidase e escolhendo um substrato apropriado, é possível examinar simultaneamente outra proteína e apoptose usando os kits de peroxidase ApopTag.
Os kits de detecção de apoptose in situ ApopTag marcam as células apoptóticas em amostras de pesquisa modificando fragmentos de DNA com desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) para detecção de células apoptóticas por coloração específica.
Este manual contém informações e protocolos para o kit de detecção de apoptose in situ ApopTag.
Princípios do procedimento
Os reagentes fornecidos nos kits de peroxidase ApopTag são projetados para marcar as terminações 3′OH livres do DNA in situ com nucleotídeos quimicamente marcados e não marcados. Os nucleotídeos contidos no tampão de reação são adicionados enzimaticamente ao DNA por desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) (13, 31). A TdT catalisa uma adição independente de molde de trifosfatos de nucleotídeos às extremidades 3′-OH de DNA dupla-fita e fita simples. Os nucleotídeos incorporados formam um oligômero composto de nucleotídeo conjugado com digoxigenina e nucleotídeo não marcado em uma sequência aleatória. A proporção de nucleotídeos marcados para não marcados nos kits de peroxidase ApopTag é otimizada para promover a ligação de anticorpos antidigoxigenina. O comprimento exato do oligômero adicionado não foi medido.
Permite-se, então, que os fragmentos de DNA que foram marcados com o nucleotídeo com digoxigenina se liguem a um anticorpo antidigoxigenina que é conjugado a uma molécula repórter de peroxidase (figura 1A). O conjugado de anticorpo ligado à peroxidase cora enzimaticamente de forma permanente, intensa e localizada substratos cromogênicos, proporcionando detecção sensível em imuno-histoquímica ou imunocitoquímica (ou seja, em tecidos ou células). Esse sistema biológico-histoquímico molecular misto possibilita uma coloração sensível e específica de concentrações muito altas das extremidades 3′-OH localizadas em corpos apoptóticos.
O sistema ApopTag difere significativamente do que foi descrito anteriormente nas técnicas de marcação in situ para apoptose (13, 16, 38, 46), nas quais a ligação da avidina à biotina celular pode ser uma fonte de erro. Verificou-se que o sistema digoxigenina/antidigoxigenina é igualmente sensível aos sistemas de avidina/biotina (22). A única fonte natural de digoxigenina é a planta digitalis. Ligantes imunoquimicamente semelhantes para a ligação do anticorpo antidigoxigenina são, de modo geral, insignificantes em tecidos animais, garantindo baixa coloração de fundo. O anticorpo policlonal de ovelha purificado por afinidade é o reagente antidigoxigenina específico usado nos kits ApopTag. Esse anticorpo exibe <1% de reatividade cruzada com os principais esteroides de vertebrados. Além disso, a porção Fc desse anticorpo foi removida por digestão proteolítica para eliminar qualquer adsorção não específica a receptores celulares Fc.
Resultados usando os kits ApopTag foram amplamente publicados (vide a seção V. Referências, publicações que citam os kits ApopTag). A linha de produtos ApopTag oferece várias opções para o design de experimentos. Um pesquisador pode optar por detectar coloração por microscopia de campo claro ou de fluorescência ou por citometria de fluxo, dependendo das habilidades técnicas e do equipamento disponíveis. Há também oportunidades para estudar outras proteínas de interesse no contexto de apoptose com os kits ApopTag. Usando anticorpos conjugados com uma enzima diferente da peroxidase e escolhendo um substrato apropriado, é possível examinar simultaneamente outra proteína e apoptose usando os kits de peroxidase ApopTag.
Componentes
Tampão de equilíbrio 90416 3,0 ml -15 °C a -25 °C
Tampão de reação 91417 2,0 ml -15 °C a -25 °C
Enzima TdT 90418 0,672 ml -15 °C a -25 °C
Tampão de parada/lavagem 90419 20 ml -15 °C a -25 °C
Antidigoxigenina-peroxidase* 90420 3,0 ml 2 °C a 8 °C
Lamínulas plásticas 90421 100 cada. Temperatura ambiente.
Lâminas de controle 90422 2 cada, em Temperatura ambiente.
Substrato DAB 90423 130 μl 2 °C a 8 °C
Tampão de diluição DAB 90424 6,5 ml 2 °C a 8 °C
*anticorpo policlonal de ovelha purificado por afinidade
Número de amostras por kit: São fornecidos materiais suficientes para corar 40 amostras de tecido de aproximadamente 5 cm2 cada, quando usado de acordo com as instruções. O tampão de reação será totalmente consumido antes de outros reagentes quando os kits forem usados para amostras preparadas em lâminas.
Tampão de reação 91417 2,0 ml -15 °C a -25 °C
Enzima TdT 90418 0,672 ml -15 °C a -25 °C
Tampão de parada/lavagem 90419 20 ml -15 °C a -25 °C
Antidigoxigenina-peroxidase* 90420 3,0 ml 2 °C a 8 °C
Lamínulas plásticas 90421 100 cada. Temperatura ambiente.
Lâminas de controle 90422 2 cada, em Temperatura ambiente.
Substrato DAB 90423 130 μl 2 °C a 8 °C
Tampão de diluição DAB 90424 6,5 ml 2 °C a 8 °C
*anticorpo policlonal de ovelha purificado por afinidade
Número de amostras por kit: São fornecidos materiais suficientes para corar 40 amostras de tecido de aproximadamente 5 cm2 cada, quando usado de acordo com as instruções. O tampão de reação será totalmente consumido antes de outros reagentes quando os kits forem usados para amostras preparadas em lâminas.
Armazenamento e estabilidade
Armazene o kit entre -15 °C e -25 °C até o primeiro uso. Após o primeiro uso, se o kit for utilizado no prazo de três meses, armazene a enzima TdT (90418) entre -15 °C e -25 °C e armazene os demais componentes entre 2 °C e 8 °C.
Precauções
1. Os seguintes componentes do kit contêm cacodilato de potássio (ácido dimetilarsínico) como tampão: Tampão de equilíbrio (90416), tampão de reação (90417) e enzima TdT (90418). Esses componentes são nocivos se ingeridos; evite contato com a pele e com os olhos (use luvas e óculos de proteção) e lave as áreas de contato imediatamente.
2. O substrato DAB (3,3′ diaminobenzidina) (90423) é conhecido como um possível agente cancerígeno e o contato com a pele deve ser evitado. Se houver contato com a pele, lave com bastante dH2O.
3. Os conjugados de anticorpo (90420) contêm 0,08% de azida sódica como conservante.
4. A enzima TdT (90418) contém glicerol e não congela a -20 °C. Para maximizar a vida útil, não aqueça este reagente à temperatura ambiente antes da dispensação.
Precauções
1. Os seguintes componentes do kit contêm cacodilato de potássio (ácido dimetilarsínico) como tampão: Tampão de equilíbrio (90416), tampão de reação (90417) e enzima TdT (90418). Esses componentes são nocivos se ingeridos; evite contato com a pele e com os olhos (use luvas e óculos de proteção) e lave as áreas de contato imediatamente.
2. O substrato DAB (3,3′ diaminobenzidina) (90423) é conhecido como um possível agente cancerígeno e o contato com a pele deve ser evitado. Se houver contato com a pele, lave com bastante dH2O.
3. Os conjugados de anticorpo (90420) contêm 0,08% de azida sódica como conservante.
4. A enzima TdT (90418) contém glicerol e não congela a -20 °C. Para maximizar a vida útil, não aqueça este reagente à temperatura ambiente antes da dispensação.
Informações legais
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Exoneração de responsabilidade
Exceto quando indicado em contrário em nosso catálogo ou em outros documentos da empresa que acompanham o(s) produto(s), os nossos produtos destinam-se somente ao uso em pesquisa e não devem ser usados para qualquer outra finalidade, o que inclui, dentre outros, usos comerciais não autorizados, usos para diagnóstico in vitro, usos terapêuticos ex vivo ou in vivo, ou qualquer tipo de consumo ou aplicação em humanos ou animais.
Palavra indicadora
Danger
Frases de perigo
Declarações de precaução
Classificações de perigo
Aquatic Chronic 2 - Carc. 1B - Muta. 2 - Skin Sens. 1 - STOT RE 2 Inhalation
Órgãos-alvo
Respiratory Tract
Código de classe de armazenamento
6.1C - Combustible acute toxic Cat.3 / toxic compounds or compounds which causing chronic effects
Certificados de análise (COA)
Busque Certificados de análise (COA) digitando o Número do Lote do produto. Os números de lote e remessa podem ser encontrados no rótulo de um produto após a palavra “Lot” ou “Batch”.
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