L-Glutamin in der Zellkultur
Warum ist L-Glutamin in der Zellkultur wichtig?
L-Glutamin ist ein häufig eingesetztes serumfreies Mediumsupplement, das in der Bioproduktion, in der Gewebezüchtung, in speziellen Zellkulturen wie der Hybridomkultur und in anderen gängigen Säugerzellkulturanwendungen eingesetzt wird. Da es sich bei L-Glutamin jedoch um eine instabile essenzielle Aminosäure handelt, sind die meisten im Handel erhältlichen Medien mit freiem L-Glutamin formuliert, das in der Basalformel enthalten ist oder den flüssigen Formulierungen zum Zeitpunkt der Verwendung zugesetzt wird.
Wir bieten Glutamin für die Zellkultur als Dipeptid oder als Proteinhydrolysat an. Einige proprietäre Medien, die in der Bioproduktion verwendet werden, werden mit L-Glutamin in Form von Dipeptiden, wie Alanyl-L-Glutamin und Glycyl-L-Glutamin, ergänzt. Eine weniger gut definierte Quelle für L-Glutamin ist die Verwendung von Proteinhydrolysaten, insbesondere von Glutenhydrolysaten. Für serumfreie oder tierproteinfreie Medien, z. B. für die Kultivierung rekombinanter Zellen aus Ovarien des chinesischen Zwerghamsters (rCHO), ist Weizengluten eine reichhaltige Peptidylglutaminquelle.
Als Zusatz in klassischen Zellkulturmedien reicht die Konzentration von L-Glutamin von 0,5 mM in Ames-Medium bis 10 mM in MCDB Medium 131. Die typischen Konzentrationen in diesen Medien für Anwendungen in der Bioproduktion und Gewebezüchtung liegen zwischen 2 und 4 mM.
Die optimale L-Glutamin-Konzentration in DMEM/F12-Nährstoffmischung beträgt 2,5 mM, während sie in serumfreiem/proteinfreiem Hybridom-Medium bei 2,7 mM liegt. Für DMEM, GMEM, IMDM und H-Y-Medium beträgt die optimale Konzentration 4 mM. IMDM wird häufig als Ausgangsformulierung für proprietäre Hybridomzellkulturmedien verwendet; Hybridomzellen wachsen besser in L-Glutamin-Konzentrationen, die über den durchschnittlichen Werten in Medien liegen.
L-Glutamin in Zellkultursystemen
Aufgrund seiner chemischen Instabilität und seiner Bedeutung für das Zellwachstum und die Zellfunktion ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Zufuhr von L-Glutamin für jeden einzelnen Zellkulturprozess optimiert wird. Glutamin hat die Summenformel C5H10N2O3 und ein Molekulargewicht von 146,15 g/mol, einen isoelektrischen Punkt von 5,65 und einen pka-Wert von 2,17 und 9,13. Das Verständnis dieser Chemie und der verschiedenen Darreichungsformen von L-Glutamin und seiner Alternativen ist Voraussetzung für den wirksamen Einsatz des Supplements in Zellkulturanwendungen.
Abbildung 1.Chemische Struktur von L-Glutamin.
Glutamin unterstützt das Wachstum von Zellen, die einen hohen Energiebedarf haben und große Mengen an Proteinen und Nukleinsäuren synthetisieren. Es ist auch eine alternative Energiequelle für sich schnell teilende Zellen und Zellen, die Glukose ineffizient nutzen. Die Zellen benötigen die Stickstoffatome in Glutamin zum Aufbau von Molekülen wie Nukleotiden, Aminosäuren, Aminozuckern und Vitaminen.
Glutamin ist eine Vorstufe von Glutamat, einer wichtigen Aminosäure, die für die Transaminierung von Alpha-Ketosäuren zur Bildung anderer Alpha-Aminosäuren verwendet wird. Es enthält ein Stickstoffatom in Form eines Amids und ein weiteres Stickstoffatom in Form eines Amins; außerdem transportiert und liefert es an die Zellen Stickstoff in Mengen, die nicht so giftig sind wie freies Ammonium.
Wenn der Glukosespiegel niedrig und der Energiebedarf hoch ist, können die Zellen Aminosäuren zur Energiegewinnung verstoffwechseln. Der Glutamin-Amid-Stickstoff wird bei der Synthese der Vitamine NAD und NADP, der Purinnukleotide, CTP aus UTP und Asparagin verwendet. Der ursprünglich in Glutamin gespeicherte Stickstoff kann auch zur Herstellung von Carbamylphosphat für die Synthese von Pyrimidinen verwendet werden. Glutamin ist eine der am leichtesten verfügbaren Aminosäuren, die als Energiequelle genutzt werden kann, und es ist eine wichtige Energiequelle für viele sich in vitro schnell teilende Zelltypen.
Glutaminstabilität in Zellkulturmedien
Wenn Glutamin als Aminosäurerest in Proteinen oder Peptiden vorhanden ist, ist es stabil. Die bedingt essentielle Aminosäure ist eine frei lösliche neutrale Aminosäure, die ein Amid der R-Gruppe enthält. Da es instabil ist, kann es in flüssigen Medien nicht-enzymatisch in Ammoniak und Pyroglutamat (Pyrrolidoncarbonsäure) zerfallen. Der allmähliche Zerfall von L-Glutamin hängt vom pH-Wert, der Temperatur und der Gegenwart verschiedener Anionen ab.
Die Glutamin-Desaminierung, eine Reaktion, bei der die Aminogruppe entfernt wird, findet sowohl unter sauren als auch unter basischen Bedingungen statt. Die Reaktion läuft wesentlich schneller ab, wenn Phosphat oder Bicarbonat im Medium vorhanden ist. Bei einer festen Phosphatkonzentration im flüssigen Medium steigt die Desaminierungsrate mit dem Anstieg des pH-Werts von 4,3 auf 10.
L-Glutamin-Biochemie
In Reaktionen, bei denen Stickstoff in Glutamat und Glutamin umgesetzt wird, werden Energieäquivalente wie NADH, NADPH oder ATP verbraucht. Glutamat wird aus Ammonium und Alpha-Ketoglutarsäure, einem Zwischenprodukt des Tricarbonsäurezyklus (TCA), synthetisiert. Diese Synthese erfordert die Oxidation von NADH oder NADPH. Die an der Glutamatsynthese beteiligten Enzyme, Glutamatdehydrogenase (EC 1.4.1.4) und Glutamatsynthase (EC 1.4.1.13), sind reversibel.
Ammonium, eine anorganische Stickstoffquelle, die von Zellen genutzt wird, wird zunächst als Amin von Glutamat oder als Amid von Glutamin in organischen Stickstoff eingebaut. Diese beiden Aminosäuren sind die wichtigsten Stickstoffreserven für die Synthese von Proteinen, Nukleinsäuren und anderen stickstoffhaltigen Verbindungen. In vivo, nicht in vitro, produziertes Ammonium, kann zu Harnstoff verstoffwechselt werden. Unter bestimmten In-vitro-Bedingungen reichert sich Ammoniak im extrazellulären Medium als Ammoniumion an.
Glutamin wird aus Ammonium- und Glutamatmolekülen synthetisiert. Bei dieser Synthese wird Energie in Form von ATP verbraucht. Das für diese Synthese verantwortliche Enzym, die Glutaminsynthetase (EC 6.3.1.2), wird stark reguliert, um die Produktion von Glutamin auf den Zellbedarf zu begrenzen. Der Katabolismus von Glutamin zu Glutamat und Ammonium wird durch mitochondriale Enzyme mit der Bezeichnung Glutaminasen (EC 3.5.1.2) vermittelt.
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