Duolink^® PLA Fluoreszenzprotokoll

In diesem Protokoll wird die Verwendung von Duolink^® PLA Reagenzien für den Immunfluoreszenznachweis, die Visualisierung und Quantifizierung von einzelnen Proteinen, Proteinmodifikationen und Proteininteraktionen in Gewebe- und Zellproben beschrieben. Wenn Sie sich mit der Duolink^® PLA Technologie vertraut machen möchten, können Sie unsere Broschüre herunterladen und den Beitrag "How to Optimize the Duolink^® Proximity Ligation Assay“ lesen, um weitere Informationen zu erhalten. Weitere Protokolle finden Sie im Duolink^® PLA Brightfield Protocol und im Duolink^® PLA Probemaker User Guide. 

Materialien und Ausrüstung
Duolink^® PLA Fluoreszenzprotokoll
Ergebnisse
Fehlerbehebung
Literatur

Materialien und Ausrüstung

Duolink^® PLA Reagenzien

Spezifische Produktempfehlungen entnehmen Sie dem Duolink^® PLA Product Selection Guide. Um einen Duolink^® PLA Versuch für den Fluoreszenznachweis durchzuführen, werden die folgenden Duolink^® PLA Produkte benötigt:

1. Duolink^® PLA Sonden (eine PLUS- und eine MINUS-Sonde aus verschiedenen Spezies, passend zu den Wirtsspezies Ihrer primären Antikörper). Jedes Kit enthält:
   1. PLA-Sonden (5x) – PLUS und/oder MINUS, je nach Produkt
   2. Blockierlösung – Zum Blockieren der Probe vor der Antikörperinkubation
   3. Antikörper-Verdünnungsmittel – Zur Verdünnung der PLA-Sonden und ggf. der Primärantikörper
   HINWEIS: Alle Bestandteile des Kits bei 4 °C lagern.

   Hinweis: Duolink^® PLA Probemaker PLUS und/oder Probemaker MINUS Kits können bei Bedarf zur Herstellung von kundenspezifischen PLA-Sonden verwendet werden. Einzelheiten hierzu sind im Probemaker-Leitfaden enthalten.

2. Duolink^® Fluoreszenz-Nachweisreagenz (zur Auswahl stehen Grün, Orange, Rot und Tiefrot). Jedes Kit enthält:
   1. Ligationslösung (5x) – verdünnt zu 1x Ligationspuffer
   2. Ligase (1 U/μl) – wird zur Herstellung der Ligationslösung hinzugefügt
   3. Amplifikationslösung (5x) – verdünnt zu 1x Amplifikationspuffer
   4. Polymerase (10 U/μl) – Zugabe zur Herstellung der Amplifikationslösung
   HINWEIS: Alle Komponenten bei -20 °C lagern.
3. Waschpuffer für Fluoreszenz (A und B)
4. Duolink^® Eindeckmedien mit DAPI (zur Verwendung auf Objektträgern, bei 2-8 °C lagern) ODER Kernfärbung und Anti-fade (zur Verwendung in Mikrotiterplatten, bei -20 °C lagern)

Weitere Materialien

1. Primärantikörper der Wahl zum Nachweis des/der Proteins/Proteine von Interesse. Muss bei Verwendung mit Duolink^® PLA Sonden in Maus, Kaninchen oder Ziege gezüchtet worden sein.
2. Hochreines Wasser (steril gefiltert, Milli-Q^® oder ähnlich)
3. Probe (Zellen oder Gewebe) auf einem Objektträger, vorbehandelt im Hinblick auf Fixierung, Rückgewinnung und Permeabilisierung. Vorschläge und Empfehlungen sowie Einzelheiten zu den folgenden Themen finden Sie unter How to Optimize the Duolink^® Proximity Ligation Assay:
   1. Versuchsaufbau und Kontrollen
   2. Auswahl der Primärantikörper und Optimierung
   3. Verarbeitung von Proben

Ausrüstung

1. Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filtern, Kamera und Software für die Bildaufnahme
2. 37 °C Inkubator
3. Orbitalschüttler
4. Beheizte Befeuchtungskammer oder Wärmeübertragungsblock für Mikrotiterplatten
5. Hydrophober Stift zur Abgrenzung des Reaktionsbereichs
6. Gefrierblock (für Enzyme)
7. Färbegläser
8. Pinzetten
9. Pipetten und Spitzen (von 1 μl bis 1000 μl)
10. Mit der Fluoreszenzmikroskopie kompatible Deckgläser

Duolink^® PLA Fluoreszenzprotokoll

Das folgende Protokoll bezieht sich auf eine 1 cm² große Probe auf einem Objektträger, wobei 40 µl der Lösung für eine angemessene Eindeckung erforderlich sind. Das Volumen abhängig von der Reaktionsfläche und Anzahl der Proben anpassen. Alle Inkubationen sollen in einer Befeuchtungskammer durchgeführt werden. Alle Waschschritte sollen bei Raumtemperatur in einem Färbeglas mit mindestens 70 ml Puffer unter leichtem Schütteln durchgeführt werden.

Vorbereitung der Reagenzien

1. Waschpuffer A und B sollen vor Beginn des Assays hergestellt werden, indem der Inhalt eines Beutels in hochreinem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml aufgelöst wird. Die Lösungen können kurzfristig bei Raumtemperatur (weniger als zwei Wochen) oder langfristig bei 4 °C gelagert werden. HINWEIS: Die Lösungen vor der Verwendung auf Raumtemperatur bringen.
2. 0,01x Waschpuffer B soll vor Beginn des Assays durch Verdünnen von 1x Waschpuffer B 1:100 in hochreinem Wasser hergestellt werden.
3. Viele Duolink^® PLA Reagenzien werden als Konzentrat geliefert und müssen unmittelbar vor der Verwendung verdünnt werden. Verdünnte Duolink^® PLA Reagenzien dürfen nicht gelagert werden.

Duolink^® PLA Protokoll

Vor dem Start sollen die Proben auf Glasobjektträger aufgebracht und im Hinblick auf Fixierung, Rückgewinnung und/oder Permeabilisierung vorbehandelt werden. Lesen Sie die Anleitung zur Optimierung des Duolink^® Proximity Ligation Assays, um weitere Informationen zu erhalten.

1. Blockieren
   1. Vortexen der Duolink^® Blockierlösung.
   2. 1 Tropfen (~40 µl) der Duolink^® Blockierlösung auf je 1 cm² Probe geben. Es ist wichtig, die gesamte Probe mit der Blockierlösung einzudecken.
   3. Die Objektträger 60 Minuten in einer beheizten Befeuchtungskammer bei 37 °C inkubieren.
2. Primärantikörper-Inkubation
   HINWEIS: Der Objektträger darf nicht trocknen, bevor der Antikörper hinzufügt wird, da dies zu einem Hintergrundrauschen führen kann.
   1. Vortexen der Duolink^® Antikörperverdünnungsmittel.
   2. Den oder die primären Antikörper mit dem Duolink^® Antikörper-Verdünnungsmittel auf die geeignete Konzentration verdünnen.
   3. Die Duolink^® Blockierlösung von den Objektträgern abklopfen.
   4. Zu jeder Probe primäre Antikörperlösung zugeben.
   5. Die Objektträger in einer Befeuchtungskammer inkubieren. Die optimale Inkubationstemperatur und -zeit für Primärantikörper verwenden.
3. Inkubation der Duolink^® PLA-Sonde
   
   1. PLUS und MINUS PLA-Sonden vortexen.
   2. Die PLUS und MINUS PLA-Sonden 1:5 im Duolink^® Antikörper-Verdünnungsmittel verdünnen.
      Für eine 40-µl-Reaktion 8 µl PLA-Sonden MINUS-Stamm, 8 µl PLA-Sonden PLUS-Stamm und 24 µl Antikörper-Verdünnungsmittel einsetzen. Ausreichend Lösung für alle Proben herstellen.
   3. Die primäre Antikörperlösung von den Objektträgern abklopfen.
   4. Die Objektträger 2x 5 Minuten in 1x Waschpuffer A bei Raumtemperatur waschen.
   5. Überschüssigen Waschpuffer abklopfen und die PLA-Sondenlösung auftragen.
   6. Die Objektträger 1 Stunde bei 37 °C in einer vorgeheizten Befeuchtungskammer inkubieren.
4. Ligation
   HINWEIS: Mit der Zugabe der Ligase bis unmittelbar vor der Zugabe zur Probe warten. Darauf achten, dass der Ligationspuffer vor der Verwendung vollständig aufgetaut und gut gemischt ist.
   1. Den 5x Duolink^® Ligationspuffer 1:5 in hochreinem Wasser verdünnen und mischen.
      Für eine 40-µl-Reaktion 8 µl des 5x-Ligationspuffers zu 32 µl hochreinem Wasser geben. Ausreichend Lösung für alle Proben herstellen.
   2. Die PLA-Sondenlösung von den Objektträgern abklopfen.
   3. Die Objektträger 2x 5 Minuten in 1x Waschpuffer A bei Raumtemperatur waschen.
   4.  Die Ligase während des Waschvorgangs mit Hilfe eines Gefrierblocks (-20 °C) aus dem Gefrierschrank nehmen.
   5. Die Ligase in einer Verdünnung von 1:40 in den 1x Ligationspuffer aus Schritt (a) geben und mischen.
      Pro 40 µl Ligationslösung 1 µl Ligase zu 39 µl des 1x Ligationspuffers geben.
   6. Überschüssigen Waschpuffer abklopfen und die Ligationslösung auftragen.
   7. Die Objektträger 30 Minuten bei 37 °C in einer vorgeheizten Befeuchtungskammer inkubieren.
5. Amplifikation
   HINWEIS: Mit der Zugabe der Polymerase bis unmittelbar vor der Zugabe zur Probe warten. Der Amplifikationspuffer ist lichtempfindlich. Alle pufferhaltigen Lösungen vor Licht schützen.
   1. Den 5x-Amplifikationspuffer 1:5 in hochreinem Wasser verdünnen und mischen. Für eine 40-µl-Reaktion 8 µl des 5x-Amplifikationspuffers zu 32 µl hochreinem Wasser geben. Ausreichend Lösung für alle Proben herstellen.
   2. Die Ligationslösung von den Objektträgern abklopfen.
   3. Die Objektträger 2x 5 Minuten in 1x Waschpuffer A bei Raumtemperatur waschen.
   4. Die Polymerase während des Waschvorgangs mit Hilfe eines Gefrierblocks (-20 °C) aus dem Gefrierschrank nehmen.
   5. Die Polymerase in einer Verdünnung von 1:80 in den 1x Amplifikationspuffer aus Schritt (a) geben und mischen.
   6. Überschüssigen Waschpuffer abklopfen und die Amplifikationslösung auftragen.
   7. Die Objektträger 100 Minuten bei 37 °C in einer vorgeheizten Befeuchtungskammer inkubieren.
6. Abschließende Waschvorgänge
   HINWEIS: Lichtempfindliche Reagenzien. Objektträger immer vor Licht geschützt aufbewahren.
   1. Die Amplifikationslösung von den Objektträgern abklopfen.
   2. Die Objektträger 2x 10 Minuten in 1x Waschpuffer B bei Raumtemperatur waschen.
   3. Die Objektträger 1 Minute in 0,01x Waschpuffer B waschen.
7. Vorbereitung auf die Bildgebung
   HINWEIS: Duolink^® In-Situ-Eindeckmedien mit DAPI sind wässrig und erstarren nicht. Zum Versiegeln der Ränder des Deckglases auf dem Objektträger kann transparenter Nagellack verwendet werden. Vermeiden, dass sich Luftblasen unter dem Deckglas bilden.
   1. Überschüssigen Waschpuffer von den Objektträgern entfernen.
   2. Die Objektträger mit einem Deckglas unter Verwendung einer minimalen Menge Duolink^® Eindeckmedium mit DAPI eindecken.
   3. 15 Minuten vor der Analyse mit einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop mit einem Objektiv (mindestens 20x) warten.
   4. Die Objektträger nach der Belichtung im Dunkeln bei 4 °C bis zu 4 Tage oder bei -20 °C bis zu 6 Monate lagern.

Ergebnisse

Bilderfassung

Das Ergebnis eines Duolink^® PLA Versuchs wird in der Regel mit einem Fluoreszenzmikroskop mit den entsprechenden Filtern für das verwendete Nachweisfluorophor betrachtet. Das Duolink^® PLA Signal wird in Form separater fluoreszierender Flecken an verschiedenen Stellen der untersuchten Zellen erkannt (Abbildung 1A). Die einzelnen Signale haben eine Größe im Submikrometerbereich und können in mehreren Fokalebenen liegen. Daher kann es notwendig sein, Bilder über die gesamte Dicke der Probe zu erhalten. Es können jedoch auch Bilder in nur einer Ebene aufgenommen werden, solange alle zu vergleichenden Bilder an einer ähnlichen Position innerhalb der Probe aufgenommen werden. Bemerkenswert ist, dass in technischen Negativkontrollen (z. B. ohne Primärantikörper, Abbildung 1B) oft nur wenige Signale nachgewiesen werden. Wenn jedoch mehr als ein oder zwei Signale pro zehn Zellen auftreten, kann eine weitere Titration des Primärantikörpers erforderlich sein.

Abbildung 1. Nachweis von EGFR in Cytospin-Präparaten von A431-Zellen mit Duolink^® PLA. Die Bilder zeigen eine Projektion der maximalen Intensität des Rohbildes auf der Grundlage von 20 z-Ebenen. Die PLA-Signale sind rot und die Kerne blau dargestellt. Das Bild des Zellkerns wurde in einer z-Ebene aufgenommen. A) Positive Reaktion. B) Negativkontrolle ohne Primärantikörper.

Es ist wichtig, dass für alle Bilder eines Versuchs identische Einstellungen (Belichtungszeit, Verstärkung, verwendete Filter usw.) eingesetzt werden. Die Einstellungen können durch Positiv- und Negativkontrollen optimiert werden. Wenn die Anzahl der PLA-Signale hoch ist, können die PLA-Signale miteinander verschmelzen (Abbildung 2). Dies kann bei der Untersuchung von stark exprimierten Proteinen oder bei der Bildaufnahme aufgrund von Überbelichtung auftreten. Daher sind die Erfassungsparameter so einzustellen, dass einzelne PLA-Signale erfasst werden. Im Duolink^® PLA Troubleshooting Guide sind Tipps zur Vermeidung von Signalkoaleszenz und zu anderen möglichen Optimierungsbereichen enthalten.

Abbildung 2. Nachweis von Her2 in FFPE-Präparaten von SKBR-3-Zellen mit hoher Expression bei Einsatz von Duolink^® PLA. Die Bilder zeigen eine Projektion der maximalen Intensität des Rohbildes auf der Grundlage von 20 z-Ebenen. Die PLA-Signale sind rot und die Kerne blau dargestellt. Das Bild des Zellkerns wurde in einer z-Ebene aufgenommen. A) Positive Reaktion. B) Negativkontrolle ohne Primärantikörper.

Bildanalyse

Es gibt verschiedene Bildanalysetools, die zur Quantifizierung von PLA-Signalen eingesetzt werden können. Die Bilddaten können auf die mittlere Fluoreszenzintensität der PLA-Signale und/oder die Gesamtzahl der PLA-Signale pro Zelle oder pro Bereich innerhalb der Zelle analysiert werden (Abbildung 3). Die Quantifizierung wird dann im Verhältnis zu technischen und/oder biologischen Kontrollen innerhalb eines gegebenen Versuchs angegeben. Eine zuverlässige Quantifizierung ist jedoch nur möglich, wenn die PLA-Signale nicht verschmolzen und die Bildpunkte nicht gesättigt sind.

Abbildung 3. Bildanalyse mit Bildbearbeitungssoftware. Die DAPI-gefärbten Zellkerne (blau) wurden automatisch erkannt und die Größe des Zytoplasmas wurde vom Benutzer geschätzt (grüne Umrisse). PLA-Signale sind rot dargestellt und stehen für das Zielprotein von Interesse. Die mit weißen Kreisen markierten PLA-Signale und die gelb umrandeten Zellkerne wurden während der Analyse quantifiziert.

Fehlerbehebung

Im Duolink^® PLA Troubleshooting Guide finden Sie Tipps und Tricks, allgemeine Richtlinien zur Fehlerbehebung und eine Reihe häufig gestellter Fragen (FAQ).

Wenden Sie sich bei Fragen zu Ihren Versuchen an unser technisches Support-Team oder an Ihren Außendienstmitarbeiter vor Ort.

Anpassungsservice

Sind für Ihren Versuch zusätzliche Anpassungen erforderlich? Lassen Sie uns die Arbeit für Sie erledigen. Erfahren Sie mehr über unser Custom Services Program zur Beschleunigung Ihrer Duolink^® PLA Projekte.

Literatur

1. Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius K, Andersson A, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, et al. 2007. In SituDetection of Phosphorylated Platelet-derived Growth Factor Receptor ? Using a Generalized Proximity Ligation Method. Mol Cell Proteomics. 6(9):1500-1509. https://doi.org/10.1074/mcp.m700166-mcp200

2. Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius K, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson L, et al. 2006. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3(12):995-1000. https://doi.org/10.1038/nmeth947

3. Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegard M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S. 2004. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(22):8420-8424. https://doi.org/10.1073/pnas.0400552101

4. Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Östman A, Landegren U. 2002. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20(5):473-477. https://doi.org/10.1038/nbt0502-473