Handgussgele für PAGE und SDS-PAGE; Verwendung mit mPAGE^® TurboMix Bis-Tris-Gelgießkits

• Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
• Polyacrylamidgel-Chemie
• Handguss von Polyacrylamidgelen
• mPAGE^® TurboMix Bis-Tris-Gelgießkits
• Demovideo
• mPAGE^® TurboMix Quick-Cast-Protokoll
• Vorbereiten der Proben und Geldurchlauf
• Bestellinformationen

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

Die Polyacrylamid-Gelektrophorese (PAGE) ist ein grundlegendes Verfahren zur Trennung von Proteinen und anderen Makromolekülen anhand ihrer elektrophoretischen Mobilität. Polyacrylamidgele entstehen durch die Polymerisation von Acrylamid-Monomeren und vernetzten Bis-Acrylamid-Molekülen. Acrylamid und Bis-Acrylamid bilden zusammen Poren, durch die Proteine migrieren können.

Polyacrylamidgele bestehen aus zwei Teilen: einem Sammelteil und einem Trennteil. Der Sammelteil des Gels besteht aus einem niedrigen Prozentanteil Acrylamid, das dazu dient, die Proben zu einer einzigen Bande zu konzentrieren, bevor sie in das Trenngel gelangen. Das Trenngel besitzt einen höheren Anteil Acrylamid, durch das die Proteine nach Größe getrennt werden. Die Acrylamidkonzentration steht in einem linearen Verhältnis zur Porengröße; eine höhere Acrylamidkonzentration führt zu kleineren Poren im Gel. Kleine Poren sind für die Abtrennung von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht wünschenswert.

Chemie des Polyacrylamidgels

In PAGE wird ein diskontinuierliches Puffersystem eingesetzt, bei dem sich das Gelpufferion vom Laufpufferion unterscheidet. Die Differenz in der elektrophoretischen Mobilität zwischen diesen beiden Ionen bildet einen sich verändernden Spannungsgradienten, den die Proteine durchlaufen. Die Tris-Glycin-Gelchemie ist das am häufigsten verwendete PAGE-System, bei dem Gele aus Tris-HCl und Laufpuffer aus Tris-Base und Glycin verwendet werden. Tris-Glycin-Gele arbeiten in einer stark alkalischen Umgebung, die zu unerwünschten Proteinmodifikationen wie Desaminierung und Alkylierung führen kann. Infolgedessen können die Proteinbanden in Tris-Glycin-Gelen verzerrt sein oder ihre Auflösung verlieren.

Im Gegensatz dazu werden bei Bis-Tris-Gelen Bis-Tris und HCl im Gelpuffer und MOPS oder MES im Laufpuffer verwendet. Bis-Tris-Gele arbeiten bei einem neutralen pH-Wert, durch den die Proteinmodifikation minimiert und die Proteinstabilität während des Geldurchlaufs gefördert wird. Dies führt zu einer schärferen Auflösung und Genauigkeit der Proteinbanden. Bis-Tris-Gele sind auch länger haltbar als Tris-Glycin-Gele, die mit der Zeit zu hydrolysieren beginnen. Bis-Tris-Gele können flexibel entweder mit MOPS- oder MES-basierten Laufpuffern kombiniert werden; der Unterschied in der Migration zwischen diesen beiden Ionen führt zu unterschiedlichen Protein-Trennungsbereichen. MES sollte verwendet werden, wenn das Protein von Interesse klein ist (< 50 kDa), während MOPS für die Auflösung von Proteinen mittlerer bis großer Größe verwendet werden sollte.

Es ist auch wichtig, die Art des bei der Proteinaufbereitung verwendeten Probenpuffers zu berücksichtigen. In Tris-Glycin-Gelen wird üblicherweise Laemmli-Puffer verwendet, um Proteine zu denaturieren und mit negativ geladenen SDS-Ionen zu umhüllen. Die Proben werden dann bei 100 °C gekocht, um die Denaturierung zu erleichtern. Durch Erwärmen des Laemmli-Puffers auf 100 °C wird der pH-Wert stark sauer und es hat sich gezeigt, dass diese Kombination aus Wärme und Säure die Spaltung von Proteinen vorzugsweise an Asp-Pro-Peptidbindungen bewirkt (Rittenhouse und Marcus, 1984). Dies führt zu offensichtlichen Proteinabbauprodukten während der Elektrophorese. Im Gegensatz dazu wird bei Bis-Tris-Gelen ein LDS-Probenpuffer verwendet, der während der Probenvorbereitung einen alkalischen pH-Wert beibehält und nicht über 70 °C erwärmt werden muss, um Proteine vollständig zu denaturieren. Bei dieser Vorbereitungsart wird die Integrität des Proteins bewahrt, indem die Spaltung der Asp-Pro-Peptidbindung minimiert wird.

Tabelle 1. Vergleich der Gelchemie von Tris-Glycin und Bis-Tris

	Tris-Glycin	Bis-Tris
Betriebs-pH-Wert	9,5 (alkalisch)	7,0 (neutral)
pH-Wert Probenpuffer	5,2	8,5
Ionenfronten	Tris (+) Glycin (-)	Tris (+) MOPS (-) MES (-)
Bereich der Proteintrennung	6 kDa - 400 kDa	6 kDa - 400 kDa
Proteinstabilität während der Trennung	Es können Desaminierung und Alkylierung auftreten	+++
Wirkung auf Asp-Pro-Peptidbindungen	Langes Erhitzen in SDS-Probenpuffer verursacht Spaltung	LDS-Probenpuffer wird unter milden Bedingungen erwärmt und die Asp-Pro-Bindungen bleiben intakt
Laufzeit	Moderat	Schnell
Haltbarkeit	Eingeschränkt	4 Wochen +

Abbildung 1. Vergleich von Tris-Glycin- (links) und Bis-Tris-Gelen (rechts). Tris-Glycin- und Bis-Tris-Gele wurden mit 12 % Acrylamid handgegossen und über Nacht polymerisiert. Die Gele wurden mit identischen E. coli-Lysat-Titrationen (Bahnen 3-6), mPAGE^® ungefärbtem Proteinstandard (Bahnen 2 und 7) und mPAGE^® Farbproteinstandard (Bahn 1) beladen. Die Gele liefen entweder in Tris-Glycin- oder MOPS-Laufpuffer, wurden eine Stunde mit ReadyBlue™ Proteingelfärbung gefärbt und eine Stunde mit entionisiertem Wasser entfärbt.

Handguss von Polyacrylamidgelen

Während vorgefertigte Polyacrylamidgele für spezielle Zwecke, wie die Analyse von Proteinen unterschiedlicher Größe auf einem Acrylamidgradienten gekauft werden können, entscheiden sich viele Forschende dafür, ihre eigenen Polyacrylamidgele von Hand zu gießen. Handgegossene Polyacrylamidgele sind im Vergleich zu vorgefertigten Gelen kostengünstig; die Herstellung der Reagenzien und die Gießausrüstung kann jedoch mühsam und zeitaufwändig sein. Variationen in der Gelpuffervorbereitung können ebenfalls zu einer inkonsistenten Leistung und Qualität des Gels führen.

mPAGE^® TurboMix Bis-Tris-Gelgießkit

Durch mPAGE^® TurboMix Bis-Tris-Gelgießkits wird die Variabilität und der Zeitaufwand des Handgießens von Gelen durch die Lieferung von vorgemischten Puffer- und Acrylamidlösungen vermieden. Das Kit enthält eine 20 % Acrylamid-Trennlösung zur Bildung des trennenden Teils eines Acrylamidgels. Die Trennlösung kann mit entionisiertem Wasser auf den gewünschten Acrylamidanteil von 8 % bis 15 % verdünnt werden. Im Kit ist darüber hinaus eine 4 % Acrylamid-Sammellösung zur Bildung des Sammelteils eines Acrylamidgels enthalten. Diese Lösungen sind so formuliert, dass sie ein Quick Casting-Verfahren ermöglichen, bei dem keine Polymerisationszeit zwischen dem Gießen des Trenn- und Sammelgels benötigt wird. Nachstehend finden Sie ein Demovideo und ein kurzes Protokoll.

Demovideo: Gießen Sie Ihre eigenen Polyacrylamid-Gele mit mPAGE^® TurboMix Bis-Tris-Kits

m PAGE ^® TurboMix QUICK-CAST-PROTOKOLL

1. Bereiten Sie das Trenngel mit dem gewünschten Acrylamidanteil vor, indem Sie mPAGE^® TurboMix-Trennlösung, entionisiertes Wasser, 10 % Ammoniumpersulfat (APS) und TEMED in ein sauberes Becherglas oder konisches Röhrchen pipettieren. Die Volumina in den Tabellen 2-4 können multipliziert werden, um mehrere Gele auf einmal zu gießen. HINWEIS: Unmittelbar vor dem Gießen 10 % APS und TEMED hinzufügen.

Tabelle 2. Herstellung von Trenn- und Sammellösungen für das Gießen von Gel. Die angegebenen Volumina reichen für das Gießen eines 7,4 x 8,2 cm großen Minigels mit 1 mm Dicke aus und können mit n (gewünschte Anzahl von Gelen) multipliziert werden, um mehrere Gele auf einmal zu gießen.

(Für 1 mm dickes Minigel)
Trenngel		Sammelgel
Gelanteil	8 %	10 %	12 %	15 %	4 %
mPAGE® TurboMix Trennlösung	2,4 ml	3,0 ml	3,6 ml	4,5 ml	n/a
mPAGE® TurboMix Sammellösung	n/a	n/a	n/a	n/a	2 ml
Entionisiertes Wasser	3,6 ml	3,0 ml	2,4 ml	1,5 ml	n/a
10 % APS	30 µl	30 µl	30 µl	30 µl	20 µl
TEMED	3 µl	3 µl	3 µl	3 µl	2 µl

Tabelle 3. Herstellung von Trenn- und Sammellösungen für das Gießen von Gel. Die angegebenen Volumina reichen für das Gießen eines 7,4 x 8,2 cm großen Minigels mit 0,75 mm Dicke aus und können mit n (gewünschte Anzahl von Gelen) multipliziert werden, um mehrere Gele auf einmal zu gießen.

(Für 0,75 mm dickes Minigel)
Trenngel		Sammelgel
Gelanteil	8 %	10 %	12 %	15 %	4 %
mPAGE® TurboMix Trennlösung	1,8 ml	2,25 ml	2,7 ml	3,38 ml	n/a
mPAGE® TurboMix Sammellösung	n/a	n/a	n/a	n/a	1,5 ml
Entionisiertes Wasser	2,7 ml	2,25 ml	1,8 ml	1,12 ml	n/a
10 % APS	22,5 µl	22,5 µl	22,5 µl	22,5 µl	15 µl
TEMED	2,25 µl	2,25 µl	2,25 µl	2,25 µl	1,5 µl

Tabelle 4. Herstellung von Trenn- und Sammellösungen für das Gießen von Gel. Die angegebenen Volumina reichen für das Gießen eines 7,4 x 8,2 cm großen Minigels mit 1,5 mm Dicke aus und können mit n (gewünschte Anzahl von Gelen) multipliziert werden, um mehrere Gele auf einmal zu gießen.

(Für 1,5 mm dickes Minigel)
Trenngel		Sammelgel
Gelanteil	8 %	10 %	12 %	15 %	4 %
mPAGE® TurboMix Trennlösung	3,6 ml	4,5 ml	5,4 ml	6,75 ml	n/a
mPAGE® TurboMix Sammellösung	n/a	n/a	n/a	n/a	3,0 ml
Entionisiertes Wasser	5,4 ml	4,5 ml	3,6 ml	2,25 ml	n/a
10 % APS	45 µl	45 µl	45 µl	45 µl	30 µl
TEMED	4,5 µl	4,5 µl	4,5 µl	4,5 µl	2 µl

2. Bereiten Sie das Sammelgel vor, indem Sie die mPAGE^® TurboMix Sammellösung in ein sauberes, separates Becherglas oder konisches Röhrchen pipettieren und die erforderliche Menge an TEMED und 10 % APS hinzufügen. HINWEIS: Unmittelbar vor dem Gießen 10 % APS und TEMED hinzufügen.
3. Mischen Sie die Reagenzien vorsichtig und vermeiden Sie dabei das Eindringen von Luftblasen in die Gelmischung.
4. Füllen Sie mit einer serologischen Pipette jede Kassette bis zur gewünschten Höhe mit Trenngel.
5. Setzen Sie die serologische Pipette in der Mitte der Kassette an und geben Sie das Sammelgel vorsichtig bis zum oberen Rand der kurzen Platte hinzu. An der Stelle, an der pipettiert wird, kann eine Vertiefung auftreten, die sich aber wieder ausgleicht.
6. Führen Sie den Kamm schnell und vorsichtig ein, damit sich keine Luftblasen unter den Zähnen festsetzen.
7. Lassen Sie die Gele eine Stunde polymerisieren.
8. Die Gele können sofort verwendet oder in mit entionisiertem Wasser getränkte Papiertücher eingewickelt und in einem luftdichten Behälter bei 4 °C bis zu 4 Wochen gelagert werden.

Vorbereiten der Proben und Geldurchlauf

1. Bis-Tris-Gele erfordern LDS-Probenladepuffer, der alkalischer als SDS-Probenpuffer ist. Die Proben können mit DTT oder β-Mercaptoethanol reduziert oder je nach Anwendung unreduziert verwendet werden. Bereiten Sie Ihre Proben gemäß Tabelle 5 vor.
   

Tabelle 5. Beispiel einer PAGE-Probenvorbereitung. Die Endkonzentration des LDS-Probenpuffers soll 1X sein. Die Endkonzentration von DTT soll 0,1 M sein.

	Reduziert	Nicht reduziert
Probe	6,5 - X µl	7,5 - X µl
Entionisiertes Wasser	X μl	X μl
4X LDS-Puffer 4X LDS-Puffer	2,5 µl	2,5 µl
1 M DTT	1 µl	N/A
Gesamtvolumen	10 µl	10 µl

2. Die Proben 10 Minuten bei 70 °C erwärmen (nicht kochen).
3. Proben und Proteinstandard in die Wells geben.
4. Die gleiche Menge 1X-Ladepuffer in die leeren Wells geben.
5. Die Gele können bei 200 V durchlaufen bis der Farbstoff oder der Proteinstandard das Ende des Gels erreicht, was je nach Gelanteil etwa 30-60 Minuten dauert.