O-Linked Glycan 策略

釋放 O 連結聚糖或 O-聚糖可能涉及各種步驟，包括使用外糖苷酶移除不同的非還原末端殘基。請繼續閱讀，瞭解 O-連結聚糖的策略，例如 O-糖苷酶的作用，以及如何去除二、三氨酰化、β-連結半乳糖和 N-乙醯葡萄糖胺。O-糖苷酶

去除Sialic酸殘留

Other O-Linked Oligosaccharide Modifications

材料

N 連結寡糖可使用 PNGase F 移除，但在移除完整的 O 連結糖方面，沒有任何酵素可與 PNGase F 相提並論。O-Glycosidase (也稱為 Endo-α-N-acetylgalactosaminidase 或 O-Glycanase) 會水解絲氨酸或蘇氨酸連結的未取代 O-glycan 核心 [Gal-β(1→3)-GalNAc]（圖 1）。核心結構的任何修改都會阻礙 O-糖苷酶的作用。為了避免這個問題，可以使用外糖苷酶（如sialid酶）在O-糖苷酶處理之前或同時將糖型還原為核心結構。

圖 1. O 型糖苷酶的裂解位點和結構要求。任何對核心結構的修改都會阻止裂解。

單糖必須依序經由一系列外糖苷酶水解，直到只剩下 Gal-β(1→3)-GalNAc 核心為止。O-Glycosidase (ex. 324716)接著可以移除完整的核心結構，而絲氨酸或蘇氨酸殘基則不會被修飾。¹糖蛋白的變性似乎不會顯著增強O-脫糖基化。

化學釋放

O-聚糖的化學釋放通常包括製造鹼性條件，以產生 β-消除反應來釋放 O-聚糖。然而，由於苛刻的鹼性條件，有時候釋放的 O-聚糖會在通常所說的「剝離反應」中進一步降解。為了減輕這些影響，GlycoProfile™ Portfolio EZGlyco^® O-Glycan Prep Kit 使用高活性胺和有機超級碱來獲得高回收率，並將「剝離」減至最低。本試劑組還包含所有必要試劑，可在 5 小時內輕鬆完成 O-糖樣品製備。

去除鍵合酸殘基

核心 Gal-β(1→3)-GalNAc最常見的修飾是單(mono)、二(di)或三(trisialylation)。^2,3,4,5這些半乳醯酸殘基很容易被α-(2→3,6,8,9)-神經醯胺酶（ex.N8271），因為只有這種酵素能夠有效地裂解 NeuAc-α(2→8)-NeuAc鍵（圖 2）。

圖 2. 在順序的糖化裂解過程中，二ialylated 和三ialylated O-連結的聚糖會被α-(2→3,6,8,9)-neuraminidase移除sialic acid residues (NeuNAc)。然後，核心 1 型聚糖會被 O-糖苷酶從 O-連結處裂解。

β鏈結半乳糖和N-乙醯葡萄糖胺

另一種常見的 O 連結六糖結構包含 β(1→4)- 連結的半乳糖 (Gal) 和 β(1→6)- 連結的 N-乙醯葡萄糖胺 (GlcNAc) 以及矽酸。^7,8水解這種聚糖除了需要神經氨酸酶外，還需要β(1→4)特異性半乳糖苷酶（ex.A6805）（圖 3）。非特异性半乳糖苷酶（ex.G5635）會水解核心聚糖中的β(1→3)-半乳糖，並留下無法被O-糖苷酶去除的O-連鎖GalNAc殘餘物。

圖 3. Disialylated O-linked Core 2 hexasaccharide is sequentially degraded by (1) removal of sialic acid residues (NeuNAc) using α(2→3,6,8,9) neuraminidase, (2) removal of β(1→4)-半乳醣 (Gal) 殘基，使用 β(1→4)- 半乳糖苷酶；以及 (3) 使用 N- 乙酰葡糖胺苷酶去除 N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)。如 圖 2. 所示，剩餘的核心 1 型聚糖就可以使用 O-糖苷酶從 O-連結中裂解出來。

α-Neuraminidase (ex. N8271), β(1-4)-Galactosidase (ex.G0413）、β-N-乙酰葡糖苷酶（ex.A6805）可用於水解這些結構以及任何其他含有 α-sialic acid、β(1-4)-linked galactose (Gal)或β-linked N-acetylglucosamine (GlcNAc)，如聚乳醣胺 (圖 4)。

圖 4. 含有 β(1→4)-linked galactose (Gal) 和 β(1→6)-linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) 的 O 連結六糖結構，以及二和三叉化的 O 連結聚糖。

其他 O-連鎖寡糖修飾

在 O-連鎖寡糖上發現的較少見的修飾包括 α-連鎖半乳糖 (Gal) 和 α-連鎖岩藻糖。^8.9 α-Gal 已被發現是動物組織中常見的過敏原，可導致肉類過敏或異種移植免疫原性。 ¹⁰ 非特異的α-半乳糖苷酶 (ex. G8507)可用來水解此類連結。直接連接到肽骨架的 N-乙醯葡糖胺（在核蛋白上發現）和 α 連接的 N-乙醯半乳糖胺（在黏蛋白中發現）也有報導。¹¹ 當這些殘基存在時，額外的外糖苷酶對於完整的 O-去糖基化是必要的。目前無法以酵素方式去除直接與蛋白質 O-連結的岩藻糖和甘露糖。 ^12,13

材料

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參考資料

1. Iwase H, Hotta K. Release of O-Linked Glycoprotein Glycans by Endo-?-N-Acetylgalactosaminidase.151-160. https://doi.org/10.1385/0-89603-226-4:151

2. Fukuda M, Lauffenburger M, Sasaki H, Rogers ME, Dell A. 1987. Structures of novel sialylated O-linked oligosaccharides isolated from human erythrocyte glycophorins.. Journal of Biological Chemistry. 262(25):11952-11957. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)45301-x

3. P?hlsson P, Blackall DP, Ugorski M, Czerwinski M, Spitalnik SL. 1994. Biochemical characterization of theO-glycans on recombinant glycophorin A expressed in Chinese hamster ovary cells. Glycoconjugate J. 11(1):43-50. https://doi.org/10.1007/bf00732431

4. Saito S, Levery S, Salyan M, Goldberg R, Hakomori S. 1994. Common tetrasaccharide epitope NeuAc alpha 2?>3Gal beta 1?>3(Neu-Ac alpha 2?>6)GalNAc, presented by different carrier glycosylceramides or O-linked peptides, is recognized by different antibodies and ligands having distinct specificities.. Journal of Biological Chemistry. 269(8):5644-5652. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(17)37509-9

5. Spiro RG, Bhoyroo VD. 1974. Structure of the O-Glycosidically Linked Carbohydrate Units of Fetuin. Journal of Biological Chemistry. 249(18):5704-5717. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(20)79875-3

6. UCHIDA Y, TSUKADA Y, SUGIMORI T. 1979. Enzymatic Properties of Neuraminidases from Arthrobacter ureafaciens. 86(5):1573-1585. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jbchem.a132675

7. HARRD K, DAMM JBL, SPRUIJT MPN, BERGWERFF AA, KAMERLING JP, DEDEM GWK, VLIEGENTHART JFG. 1992. The carbohydrate chains of the beta subunit of human chorionic gonadotropin produced by the choriocarcinoma cell line BeWo. Novel O-linked and novel bisecting-GlcNAc-containing N-linked carbohydrates. Eur J Biochem. 205(2):785-798. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1992.tb16843.x

8. Wilkins PP, McEver RP, Cummings RD. 1996. Structures of the O-Glycans on P-selectin Glycoprotein Ligand-1 from HL-60 Cells. Journal of Biological Chemistry. 271(31):18732-18742. https://doi.org/10.1074/jbc.271.31.18732

9. Glasgow L, Paulson J, Hill R. 1977. Systematic purification of five glycosidases from Streptococcus (Diplococcus) pneumoniae. Journal of Biological Chemistry. 252(23):8615-8623. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(19)75265-x

10. Jin C, Cherian RM, Liu J, Playà-Albinyana H, Galli C, Karlsson NG, Breimer ME, Holgersson J. 2020. Identification by mass spectrometry and immunoblotting of xenogeneic antigens in the N- and O-glycomes of porcine, bovine and equine heart tissues. Glycoconj J. 37(4):485-498. https://doi.org/10.1007/s10719-020-09931-1

11. Jiang M, Hart GW. 1997. A Subpopulation of Estrogen Receptors Are Modified by O-Linked N-Acetylglucosamine. Journal of Biological Chemistry. 272(4):2421-2428. https://doi.org/10.1074/jbc.272.4.2421

12. Stults NL, Cummings RD. 1993. O-Linked fucose in glycoproteins from Chinese hamster ovary cells. Glycobiology. 3(6):589-596. https://doi.org/10.1093/glycob/3.6.589

13. Chiba A, Matsumura K, Yamada H, Inazu T, Shimizu T, Kusunoki S, Kanazawa I, Kobata A, Endo T. 1997. Structures of Sialylated O-Linked Oligosaccharides of Bovine Peripheral Nerve ?-Dystroglycan. Journal of Biological Chemistry. 272(4):2156-2162. https://doi.org/10.1074/jbc.272.4.2156