免疫沉澱的 Western 印迹分析 (IP-Western)

IP-Western分析仍是鑑定蛋白質-蛋白質互作和鑑定多蛋白複合物中未知蛋白質的常用技術。步驟包括細胞裂解、形成抗體-抗原（免疫）複合物、沉澱免疫複合物，以及利用 Western 印跡進行分析。

閱讀更多

• 高背景。
• 沒有目標蛋白被洗出，或洗出的目標蛋白不足
。
• 免疫沉澱珠的選擇指南

相關產品

抱歉，發生意外錯誤。

Network error: Failed to fetch

高背景

圖 1. 高背景，導致 Western 印跡上出現非特異帶。

Possible Cause                  <		Remedy
Non-specific binding to beads	使用瓊脂糖珠時，進行預先清除步驟。在蛋白混合物中加入非包被的瓊脂糖珠（在加入抗體包被的珠子之前），可以去除與瓊脂糖非特異性結合的蛋白質。 在加入抗體之前，確保珠子被 BSA 適當阻斷。 減少珠子的體積。
洗滌緩衝液不夠嚴格	改用更嚴格的緩衝液，例如以 RIPA 為基礎的緩衝液。
非特异性抗体结合	减少孵育时间、裂解液体积/浓度和/或抗体浓度。 使用更特異的抗體。
洗滌不充分	增加洗滌次數和/或洗滌更長時間。 增加洗滌緩衝液的嚴格度。 倒置試管數次，以確保充分洗滌。

未洗出目標蛋白質，或洗出的目標蛋白質不足

。

Possible Cause	Remedy
	所有步驟均在 4 °C 進行。 在裂解步驟中蛋白質降解、去磷酸化和變性	在 4 °C 下執行所有步驟。確保蛋白酶和磷酸酶抑制劑的用量充足。
Lysis buffer too stringent	改用中度或低度的緩衝液，例如以 NP-40、Triton® X-100 或 PBS 為主的緩衝液。
未與珠子結合的抗體	確定珠子與抗體同類型相匹配。
抗體與抗原結合不足
沉澱步驟中琼脂糖珠意外脫落	確保琼脂糖珠沒有被吸到移液管中。 使用磁珠代替琼脂糖珠，以減少/消除珠子流失。
Mouse IgG or chicken antibody does not bind efficiently to protein G- or protein-A conjugated beads (for indirect immunoprecipitation)<	在沉澱步驟中加入橋接抗體，以改善這些抗體與蛋白G或蛋白A結合珠的結合。
確保適當的洗滌緩衝液類型和 pH 值。
蛋白質複合物的破壞（在共免疫沉淀實驗中）	輕輕旋轉，並使用寬吸頭以避免蛋白質複合物破壞。

最終 Western 印迹上 50 kDa 和 20 kDa 的額外帶可能會掩蓋感興趣的帶

。

圖 2. 在交聯 IP western 中，樣品中會排除一抗的重鏈和輕鏈。

Possible Cause	補救方法
一抗的重鏈和輕鏈被二抗識別	使用可檢測原生 （非變性）免疫球蛋白的第二抗體。 使用交聯 IP，首先使用 DSS 將蛋白 A 或 G 珠與擷取抗體交聯

選擇免疫沉澱珠指南

相對親和力
蛋白質 A/G 混合液	Lambda Ig Binder	Kappa/Lambda Mix*
兔IgG	SA	SA	SA		<
小鼠 IgM	RE	SA	<
小鼠 IgG3<	SA	MSA	SA
小鼠IgG2b	SA	SA	SA	<
小鼠 IgG2a	SA	SA	SA
Mouse IgG1	MSA	MSA	MSA
人類 IgM	MSA		MSA	MSA	SA
人類IgE	MSA	MSA		MSA	MSA	SA
人類 IgD	MSA	MSA		MSA	MSA	SA
人類IgA	MSA	MSA		MSA	MSA<<	SA
人IgG4	SA	SA	SA	SA	MSA	MSA	SA
人類 IgG3	SA		SA	MSA	MSA	SA
人IgG2	SA	SA	SA	MSA	MSA	SA
人IgG1	SA	SA	SA	SA<	MSA	MSA	SA
大鼠 IgM	RE	RE
Rat IgG2c	MSA	RE	MSA
大鼠 IgG2b	MSA	RE	MSA
大鼠IgG2a2a	SA	RE	SA
大鼠 IgG1	MSA	RE	MSA
大鼠 IgG	MSA	SA	SA

蛋白質 A/G 混合	Kappa Ig 粘合劑	Lambda Ig 粘合劑					SA	MSA
Human k				SA		MSA
人類 Fc	MSA	MSA	MSA
人scFv	MSA	MSA		RE	RE	RE
人類F(ab')2	MSA	MSA	MSA	MSA	MSA	MSA	SA
人類 F(ab)	MSA	MSA	MSA	MSA	MSA	SA
蛋白質A和G的相對親和力的關鍵代碼；PureProteome™ Kappa和Lambda磁珠的抗體：SA = 強親和力；MSA = 中等/輕微親和力；RE = 需要評估 *PureProteome™ Kappa/Lambda 混合物不是目錄項目。只需單獨採購 Kappa 和 Lambda 珠子，然後以 1:1 的比例混合即可。