使用 Atto 647N NTA 進行單分子檢測

Ruud Hovius, Emmanuel Guignet, Jean-Manuel Segura, Joachim Piguet, Horst Vogel

使用優異的螢光 NTA-Atto 647N 結合物顯著改善單分子追蹤

Ruud Hovius, Emmanuel Guignet, Jean-Manuel Segura, Joachim Piguet &HorstVogel（Institute de Science Biomoleculaire, EPFL, Switzerland）、Monika Bäumle （Merck）

• Atto647N是一種優秀的單分子追蹤實驗用螢光染料
• Atto647N是一種優秀的單分子追蹤實驗用螢光染料
• 卓越的標籤光穩定性使獲得的信息含量顯著增加

螢光 NTA 結合物的一般優勢

荧光 NTA 共轭化合物已被用于检测印迹、凝胶或溶液中的寡聚组氨酸标记蛋白质（图 1）。最近，這種方法已經擴展到活細胞中蛋白質的檢測和表徵（Guignet 2004）。

圖 1. Ni-NTA 色素層與寡組氨酸標記蛋白質的互動。

此標籤方法的主要優點是：

• 可靈活使用最適合應用的螢光團 - 螢光團的性質對 NTA 探針與 His-tag 的結合特性影響甚微。
• 非常快速的動力學 - 在細胞中的標記被證實在 30 秒內完成，並且在加入強力螯合劑後的幾分鐘內完全可逆。

單分子成像 - Atto 647N 具有優異的光穩性

。寡組胞苷標記蛋白質的檢測通常涉及大量目標分子；然而，NTA 標記方法的另一個重要應用是活細胞中單個螢光標記分子的成像。在單分子成像中，螢光標籤會暴露在強烈的照射下。在這些條件下，大多數常見的標籤會發生相對較快的光分解，從而限制了可收集的圖像數量。通常，在漂白發生之前，使用寬視野照明可以擷取 10-25 張圖像，導致目標分子位移的痕跡很短。這對於可以擷取的資訊有很大的影響。舉例來說，對於已記錄 n 張影像的分子，其均方位移分析將包含 [1+ ...+(n-1)]個資料點。

Atto 647N 因其極高的光穩定性和亮度，在單分子研究方面具有極大的潛力。在一項比較實驗中，用 Cy™5 或 Atto 647N 探針標記哺乳動物細胞中表達的 ionotropic 血清素受體。單分子成像顯示 Atto 647N 的光穩定性比 Cy5 好，漂白率低 2 倍（圖 2）。Atto 647N 常規允許獲取 50 到 100 張的膠片。

圖 2. Atto 647N（綠色）的光穩定性比 Cy5（紅色）高。

上圖：使用 Cy5 標記的分子觀察到的每個分子的累積數據點數量在最大長度為 55 幀時約為 200 個。

下圖：Cy5 標記分子的痕跡長度直方圖，Cy5 標記分子的痕跡長度直方圖，Cy5 標記分子的痕跡長度直方圖，Cy5 標記分子的痕跡長度直方圖：Cy5（紅色）和 Atto 647N（綠色）標記的血清素受體探針的痕跡長度直方圖顯示，Cy5 的光漂白速度是 Atto 647N 的兩倍。

Atto 647N 可產生漫射單分子的超長軌跡

具有長軌跡的膠片可精確描述單個標記分子的漫射行為。對於軌跡較短的膠片，常規的擴散行為評估方法是繪圖在一系列相對較短的膠片中觀察到的均方位移 (MSD)，每個膠片在 12 格範圍內，分子群的均方位移與時間的關係 (圖 3A)。

Atto647N的優異特性使其能夠擷取高達約100格的影像序列（104格的範例顯示於 圖3B）。這種長度的軌跡允許評估單個顆粒的 MSD，揭示其擴散行為的細節。如果擷取只限於 12 幀，那麼就會得出顆粒是在受限區域 (限制) 內擴散的結論。

應用 Atto 647N 等光穩定性高、亮度高的螢光劑大大幫助了這些觀察。

單分子追蹤的擴散評估

圖 3a.

具有不同擴散模式的目標分子的平均平方位移 (MSD)。自由擴散分子的 MSD (D=1) 與時間成正比：MSD ∝ tⁿ⁼¹。擴散受到障礙 (D<1) 阻礙或限制在某個區域 (confined) 的分子，其 MSD ∝ t^n<1。流動或定向傳輸的分子顯示出 MSD ∝ t^n>1。

圖 3b. HEK293 細胞質膜上 NTA-Atto 647 標記的血清素受體的單分子軌跡（比例尺為 250 nm）。此單一分子共記錄 104 幀。

圖 3c. 圖 3B 所示軌跡的平均平方位移 (MSD)，顯示此分子進行自由擴散行為。

材料

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