COVID-19疫苗的快速開發和成功證明了mRNA的力量 - 但其潛力遠遠超出了這一應用：mRNA技術 有望解決尚未滿足的醫療需求，並為對抗癌症、心臟病或傳染病提供新的治療選擇。
將 mRNA 傳輸到病患細胞的細胞體內，可以誘導目標蛋白質的產生，而目標蛋白質可以發揮治療或預防的功能，也可以作為抗原來引發免疫反應以達到接種疫苗的目的，還可以取代有缺陷的蛋白質或啟動抗腫瘤反應。
與廣泛用於疫苗和基因治療的腺相關病毒 (AAV) 向量等病毒傳輸系統相比，mRNA 技術等非病毒傳輸系統具有多種優點：更好的安全性、高度的通用性，以及使用模板化製程簡化製造過程。開發科學家致力於透過優化製程與傳遞平台來提升 mRNA 的穩定性、轉譯性與安全性。
檢視我們所有的mRNA 開發與製造的產品與服務。
部分概述
圖 1.mRNA 製造的一般製程概述。
要優化製程、產量、品質和最終產品的安全性，有幾個關鍵的考慮因素。例如，這包括選擇適當的製程化學品和原料。特別是在體外轉錄和下游純化過程中，mRNA 是不受保護的，有很高的酵素降解風險。使用通過內切酶活性測試的產品，可將 mRNA 從製造到純化再到制劑的整個過程中 RNase 誘發降解的風險降至最低。為了控制微生物和內毒素污染的風險，使用特定低微生物和內毒素含量的產品也很重要。這是對注射劑等高風險應用尤其重要，因為污染微生物造成傷害的可能性增加。
本網頁專門針對 mRNA，提供技術與產品選擇的深入資訊，協助您有信心地掌握從製造到最終灌裝的 mRNA 製程。為了支援您做出明智的決定，我們在小冊子 "Enabling Capabilities and Solutions for all mRNA platforms" and "Process chemicals for mRNA drug manufacturing".
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圖 2.mRNA 結構。
- 位於序列 5' 端的帽區：對於 mRNA 成熟、被核糖體識別以進行有效的蛋白質翻譯，以及保護其免受核酸酶消化以提高穩定性，都是必不可少的。
- 位於 mRNA 編碼區上游和下游的非翻譯區 (UTR)：調控 mRNA 的翻譯、定位和穩定性；可利用其提高蛋白質的表達效率。
- 開放閱讀框或編碼序列區域：包含感興趣的基因 (GOI)。
- Poly(A)尾：防止 3' 外切酶的消化，對蛋白質的翻譯和 mRNA 的穩定性至關重要。
Making mRNA
生產以 mRNA 為基礎的治療劑和疫苗 如圖 1 所示，首先以質粒 DNA (pDNA) 為模板，然後將其線性化並轉錄為 RNA：
- pDNA製作：pDNA模板包含DNA依賴的RNA聚合酶啟動子和mRNA結構的相應序列。鑑於 pDNA 建構體的核心作用，其設計和純度是優化 mRNA 產品的重要因素。所需的 pDNA 會在細菌細胞（通常是 大腸桿菌）中擴大，隨後的純化步驟會產生純淨、濃縮的環狀 pDNA。克服核酸大尺寸及其高粘度、剪切敏感性以及 pDNA 與雜質之間相似性等相關挑戰的策略，將在我們的出版物 "Designing a Plasmid DNA Downstream Purification Process"。
- pDNA線性化：迴圈 pDNA 在反應緩衝液1中使用限制性酵素進行線化作為 RNA 聚合酶轉錄所需 mRNA 的模板。
- pDNA純化：去除雜質，例如限制性酵素、牛血清白蛋白 (BSA)、DNA 片段、內毒素等。大多數實驗室規模的製程都是利用溶劑萃取技術，但不適用於 GMP 生產環境。作為替代方案，切向流過濾 (TFF) 和層析是此純化步驟中有效的雜質去除技術。內毒素已被確認為 pDNA 製造過程中的重要雜質，對後續製程步驟有很大影響，最終也會影響病患的安全。洗滌劑可用於去除內毒素，例如使用 Deviron® C16 洗滌劑 作為一種合適的可持續、可生物降解且符合 REACH 標準的傳統洗滌劑替代品。2
瞭解更多關於pDNA 的生產和純化 ，請參閱我們的專題技術文章。
- 體外轉錄 (IVT)：線性化的 pDNA 作為 DNA 範本，在酵素反應中利用自然轉錄過程的元素轉錄成 mRNA。體外轉錄中的關鍵元件包括將 DNA 序列轉錄為 RNA 序列的 RNA 聚合酶、作為 mRNA 組成塊的核苷三磷酸鹽 (NTP)、提高 mRNA 產量的無機焦磷酸酶 (IPP) 以及防止 RNA 降解的 RNase 抑制劑。在轉錄緩衝液中，典型的化學物質如二硫蘇糖醇（無機焦磷酸酶（IPP）。a href="/product/mm/137165">spermidine（提高轉錄效率和核酸穩定性的成分）。
- 拉曼作為一種強大的分析工具，有可能用於監測酵素反應，例如 IVT 步驟。迄今為止，為了監控 IVT 步驟，必須執行繁瑣的離線分析，因此無法在反應條件和/或生產力目標未達時立即採取行動。拉曼光譜技術可以解決這個問題，它可以更快速地測量 CPPs & CQAs，讓操作人員可以更快速地做出決策，以確保最佳的製程條件。
- 加帽：在轉錄之後，最終的 mRNA 結構需要一個 5' 的加帽結構，以確保穩定性和在細胞中的有效轉導。
- 共轉錄加蓋，通常在轉錄混合物中使用加蓋類似物和三磷酸鸟苷 (GTP)，添加比例為四個加蓋類似物對一個 GTP。與酵素封頂相比，共轉錄封頂的成本較低且速度較快，因為它是在 IVT 步驟中，在相同的反應器混合液中進行。然而，效率和產量較低，而且可能會因為錯誤結合或反向納入而產生非封頂雜質。反向封頂類似物 (Antireverse cap analogs, ARCA) 已經被開發出來，可以防止 5' cap 的反向納入，從而提高翻譯效率。
- 酵素封頂（或稱轉譯後封頂）是在從體外轉錄混合物中純化 mRNA 之後進行的。此反應通常使用疫苗病毒封頂酵素將封頂結構加入 mRNA 結構中。雖然酵素鎖蓋的鎖蓋效率非常高，但成本較高，而且需要額外的單元操作。
這些製程步驟之後會進行 mRNA 的純化和配制，以獲得最終的藥物產品。
PURIFYING mRNA
經過 體外 ；轉錄步驟後，mRNA 會從之前步驟中使用的雜質和材料中純化出來，包括內毒素、免疫原性雙股 RNA (dsRNA)、殘留的 DNA 模板、RNA 聚合酶和元素雜質。在此階段，mRNA 需要在適當的緩衝液中進行 TFF、酵素封頂和/或層析步驟。有幾種選項可用於 mRNA 純化和去除殘留 DNA：
- 切向流過濾 (TFF) 用於有效地將 mRNA 與膜無法截留的較小雜質分離。一般而言，DNA 範本會透過加入 DNases 而降解；然後所產生的小 DNA 片段便可利用 TFF 輕易從較大的 mRNA 分子中分離出來。根據 mRNA 的大小，可使用 30 至 300 kDa 的分子量截距。使用 TFF 可以在相同的單元操作中完成產品的純化、濃縮和重濾。但是，小的 DNA 片段可能會與 mRNA 杂交，產生額外的雜質，如果使用捕獲技術去除 DNA 模板，就可以避免這種情況。3
- 層析技術，例如反相離子對 (IPPP)、 ；陰離子交換 (AEX) 和使用 poly(dT) 捕獲的親和層析 (AC) (圖 3) 提供了去除 DNA 模板的有效方法，省去了 DNA 模板消化的需要和在超/過濾步驟中可能發生的雜交風險。1 為了去除不需要的產物和寡核苷酸雜質，在酵素封頂步驟後也會使用層析技術。然而，這種方法較為昂貴，而且介質交換和後續步驟的準備仍然需要 TFF 步驟。
圖 3：比較反相離子對、陰離子交換和親和色譜法用於 mRNA 純化（DBC：動態結合能力）。
- Reversed-phase ion pairing (IPRP) is commonly used at small scale and allows a very efficient and rapid RNA purification and good separation of single stranded RNA (ssRNA) from DNA, double stranded RNA (dsRNA), and short transcripts.此方法的缺點包括：溶劑的使用會影響 GMP 製造的適用性；mRNA 會被離子對試劑複合，需要重過濾步驟來去除複合物；對蛋白質和聚合體的汙染很敏感，使得此技術更適合研磨而非擷取。
- Anion exchange chromatography (AEX) 具有 > 10 mg RNA/mL 的高動態結合能力，可非常有效地去除免疫原性雜質，如 dsRNA、未封裝 RNA、RNA-DNA 混合體和其他 RNA 結構，如髮夾 mRNA。雖然 AEX 允許使用水溶液，但可能需要添加具有潛在毒性的混沌劑，並在高達 85 °C 的溫度下進行操作，以解吸附在樹脂上的大型 mRNA 分子。5
- Affinity chromatography (AC) poly(dT) capture 使用樹脂專門擷取全長 mRNA transcripts 的 poly(A) 尾端。此製程可有效去除 DNA、核苷酸、酵素、緩衝液成分和任何其他沒有 poly(A) 尾部的雜質。與 AEX 相同，它允許使用水溶液，在 AC 的情況下通常是鹽梯度。與 IPRP 和 AEX 不同的是，AC 無法區分 dsRNA 和 ssRNA，也無法有效去除其他與產品相關的雜質，例如與 mRNA 杂交的 DNA 片段。
- 層析步驟之後會進行最終濃縮和重過濾，以最大限度地提高產品純度，並將 mRNA 轉移到適當的緩衝液中進行配制或儲存。在此階段，mRNA 可在相同的單元操作中進一步純化、濃縮及重濾。TFF 步驟之後可以進行無菌過濾步驟；然而，分子量為 5000 kDa 或更高的 mRNA 的無菌級過濾可能具有挑戰性。
MFORMULATING THE mRNA
經過最後的 mRNA 純化步驟後，接下來要考慮的是遞送機制 (圖 4)。遞送工具對於確保 mRNA 疫苗和治療藥物的有效性至關重要。最先進的傳輸方法之一是以脂質和聚合物的組合為基礎，包括寡核苷酸與脂質結合形成脂聚體的複合物，或帶正電荷的聚合物（如聚乙烯亞胺 (PEI)）形成多聚體。脂質奈米粒子 (LNP) 是最常用的 mRNA 傳輸平台。
圖 4.有幾種 mRNA 傳輸系統可供使用。
脂質選擇的注意事項
選擇脂質時，必須考慮傳輸途徑，以確保最大的效果和最佳的生物分布。除了脂質的選擇之外，個別脂質之間的比例也是微調的關鍵，會直接影響雙層的流動性和 LNP 的融合性。在選擇脂質時，有多個關鍵因素在起作用，包括類型、來源和品質，這些因素會直接影響最終配方中的雜質概況和特性，如顆粒特性、穩定性和釋放概況。一致的脂質品質是重現結果的必要條件，這在很大程度上取決於合成脂質的原料品質和脂質的材料特性。 合成脂類 具有穩定、高品質的產品，以及由可信賴的合作夥伴提供量身訂做的支援與服務 是滿足個別需求的理想選擇，並可確保最終產品的最佳效能。
每個 LNP 由四種不同的脂質組成，可將 mRNA 攜帶其中並保護其免於降解：
- 陽離子/可離子脂質 需要透過靜電相互作用來包覆 RNA。傳遞至肝細胞（用於增強或抑制蛋白質表達）需要可離子化的脂質（被動靶向、內體釋放），而免疫細胞的吸收則容易得多。強陽離子脂質也可達到此目的，負責將 RNA 有效釋放到細胞質中。陽離子脂質的結構會顯著影響 LNP 的活性、毒性和生物分布。
- 聚乙二醇 (PEG) 脂質 可提供膠體穩定性，防止蛋白質與微粒結合，從而使微粒免受免疫系統的影響，並實現更長時間的循環。PEG 鏈和脂肪酸鏈的長度決定了循環壽命和融合性，或微粒與 LNP 內體膜的融合程度。若要延長循環時間，可使用較長的脂肪酸鏈，例如聚乙二醇甘油酯 (DSG PEG 2000)。PEG 濃度也會影響顆粒大小。
- 中性/負離子脂質 提供結構穩定性，並在確定融合性和生物分布方面發揮作用。1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine. 例如，研究表明，與1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPC)相比，含有1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)（在內體釋放中發揮重要作用）的LNPs可使mRNA向肝臟的遞送得到增強。5研究結果顯示，這些輔助脂質也有助於 RNA 的穩定包封。6
- Cholesterol is used to modulate the bilayer density, fluidity and uptake (raft formation) of the LNP.雖然市面上有動物衍生的膽固醇和合成膽固醇，但合成膽固醇有幾個優點，包括純度更高、不含動物衍生的分子（如朊病毒）、可擴展性和高度穩定的品質。
純化的 mRNA 可以透過不同的技術配制成遞送粒子。在常用的溶劑注射技術中，將脂質溶解在乙醇等溶劑中，然後在含有 mRNA 的水性低 pH 緩衝液中快速混合，使用交叉流混合或微流控混合技術製成 LNPs。然後將低 pH 緩衝液重過濾成中性緩衝液，再使用超濾來濃縮微粒。TFF 步驟必須快速，因為脂質在低 pH 值下會水解，導致形成雜質，如水脂質，影響脂質雙層結構、製劑穩定性和藥物釋放特性。脂質的降解也會增加微粒的尺寸，導致聚集。
LNPs 與其他傳輸系統相比，具有非常好的穩定性、結構可塑性和增強的基因傳輸能力。與裸 mRNA 相比，它們能提高轉染率，允許靜脈注射而不會有被血液中存在的 RNase 降解的風險，如果加入特定配體，還能實現主動靶向。LNPs 的缺點包括可能需要冷鏈物流。此外，LNPs 並非總是能進行無菌過濾，在這種情況下必須考慮其他替代方法，例如伽馬輻照、熱消毒、高壓消毒或封閉處理。
有關 mRNA 制劑的更多資訊，請閱讀我們的白皮書 "Considerations for Advancing a Lipid Nanoparticle Formulation to Clinical and Commercial Manufacturing".
.擴大 mRNA 製造過程時有幾個注意事項，在小規模製造過程開發時應該將它們放在首位。
- 使用溶劑萃取和沉澱步驟進行 mRNA 純化的方法難以擴大規模 而且使用有害溶劑不適合 GMP 環境，可以用 TFF 或層析技術取代。
- 由於 mRNA 可在幾秒鐘內被 RNases 降解，因此與產品接觸的每一種原料、溶液和設備都必須不含這些酵素。
- 適當的傳輸系統有助於疫苗或療法的效率，因此應謹慎選擇。
- 如果最終產品是大型 mRNA 複合物，則應評估無菌過濾產品的替代方案。
- 對供應鏈的特殊要求（如冷鏈）是一個重要的成本動因。因此，應仔細評估藥物的穩定性。
參考資料
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