從加工植物油和小麥麵粉中檢測基因組 DNA

E. Sonke, BMSc¹, W. Kim, Ph.D¹, Y. Haj-Ahmad, Ph.D^1,2

¹Norgen Biotek Corporation, Thorold, Ontario, Canada, ²Centre for Biotechnology. Brock University, St. Catharines, Ontario, Canada

Product No. E5038

引言

在現今的農業和食品工業中，食品加工行為非常普遍，而且通常會對植物和植物產品的遺傳資訊造成嚴苛的影響。常見的橄欖油、芝麻油和植物油等，在經過高壓和高溫處理後，通常只含有微量的遺傳資訊 (植物 DNA 或 RNA)，而且這些 DNA 大多品質不佳¹。開發能夠從橄欖油中分離出微量高品質 DNA 的方案，對橄欖油產業和依賴其生產的經濟體系都非常重要²。用成本和價值較低的油攙雜純正的橄欖油是業界日益關注的問題，而這些做法可以透過建立和追蹤食品的基因來源來加以規範³。

食品消費者心目中另一個日益關注的問題是將轉基因生物 (GMO) 引進日常食品供應中。植物油生產商目前被允許在其產品中加入 GMOs，雖然小麥產業不允許使用 GMOs，但最近在北美發現了 GMO 小麥品系^4,5。基因改造的檢測只能透過 DNA 分析來完成，而從加工過的小麥（小麥粉）中分離出品質優良的 DNA 是相當困難的⁶。

Norgen Biotek 的植物/真菌 DNA 分離試劑盒已經證實能夠從多種植物樣本中分離出高品質的 DNA，例如煙草葉、番茄葉、葡萄葉、桃葉、李子葉和松針。此外，使用本試劑組分離出的 DNA 還可以用於 qPCR、Southern 印跡、SNP 分析和測序等下游應用。本應用說明說明，使用 Norgen 的植物/真菌 DNA 分離試劑盒，可從橄欖油、芝麻油、植物油和小麥粉中分離出適合下游 PCR 分析的 DNA。這使得我們的試劑組適合分離出高品質的 DNA，用於檢測這些食品的基因真偽。

材料和方法

DNA分離 - 油

將商店購買的橄欖油、芝麻油和菜油與等量（500 μ L）的Norgen Lysis Buffer混合。L）的 Norgen 植物/真菌 DNA 分離試劑盒中的裂解緩衝液混合，並在室温下旋轉 10 分鐘以充分混合。然後將裂解液在 65 °C 下孵育 10 分鐘，間歇性攪拌以確保水層與非水層不分離。為了分離上清液，裂解液以 14,000 rpm 離心 5 分鐘。然後將約 350 μL 的上清液與等量的 70% 乙醇混合，並將此溶液通過 Norgen 的柱子以結合 DNA。經過一系列的洗滌步驟後，DNA 被洗滌在洗滌緩衝液（Elution Buffer）中，準備進行 PCR 擴增。

DNA分離--小麥粉

將商店購買的小麥粉稱出5、10、15、20、30、40和50 mg等分量，與500 µL的裂解緩衝液和100 µL的裂解添加劑混合，並簡單攪拌。然後將裂解液在 65 °C 下孵育 10 分鐘以進行裂解。為了分離上清液，裂解液以 14,000 rpm 離心 5 分鐘。然後將約 350 µL 的上清液與等量的 70% 乙醇混合，並將此溶液通過 Norgen 的柱子以結合 DNA。經過一系列的洗滌步驟後，DNA 被洗滌在洗滌緩衝液（Elution Buffer）中，準備進行 PCR 擴增。

PCR 擴增

純化的 DNA 然後用作端點 PCR 反應的模板。為了擴增植物基因組 DNA，將 2 μL 離離的 DNA 加入含有 0.5 μM 18S rDNA 引物的 18 μL 反應混合物中。使用下列程式執行反應：95 ℃ 3 分鐘初始變性，95 ℃ 15 秒變性、60 ℃ 30 秒退火及 72 ℃ 45 秒延伸 45 個週期。反應在 iCycler iQ 恆溫器 (Bio-Rad) 上進行。

凝膠電泳

為了目視分析端點 PCR 產物，將 PCR 反應的全部體積（20 µL）載入
1% 琼脂糖 TAE 凝膠，在 150 V 下與 Norgen's HighRanger 1 kb DNA ladder 一起運行 25 分鐘。使用 AlphaImager™ IS-2200 (Alpha Innotech) 拍攝凝膠照片。

結果與討論

油

在 PCR 擴增之前，先將分離的 DNA 樣品放在 1% 瓊脂糖 TAE 凝膠上進行目視分析。凝膠顯示從各種油樣本中分離的 DNA 極少，而且 DNA 已經被剪切（數據未顯示）。

然而，在端點 PCR 之後，將樣品放在 1% 瓊脂糖 TAE 凝膠上進行分析，結果顯示在所有三種油的一半（1/2）重複樣本中都出現了植物 18S rDNA（520 bp）的擴增（圖 1）。這顯示加工油中的 DNA 量幾乎無法檢測到，是以勉強可追蹤的量存在。R.Testolin和O.Lain⁷ （2005）也有類似的觀察，他們也表示在他們的研究中，只有一半的橄欖油DNA樣本被擴增，原因是油樣本中存在的DNA量很低。因此，在這種情況下，DNA 品質就成為比產量更重要的因素，以確保下游應用的 DNA 可以擴增，從而避免任何假陰性檢測。因此，Norgen 的植物/真菌 DNA 分離試劑組能夠從加工過的食用油中分離出微量的 DNA，而且 DNA 的品質可被 PCR 擴增。

圖 1. 使用 Norgen's Plant/Fungi DNA Isolation Kit 從加工食品油中分離的 DNA 樣本進行終點 PCR 後得到的 18S rDNA 擴增子。葡萄 DNA 是從葉子中分離出來作為陽性對照。NTC = 無模板對照。

Wheat Flour（小麥麵粉）

在進行 PCR 擴增之前，先將從小麥麵粉中分離出來的 DNA 樣品放在 1% 的瓊脂糖 TAE 凝膠上。與油樣品不同的是，從含有少於 20 mg麵粉的樣品中分離出了剪切但仍可見的 DNA（數據未顯示）。

在檢測植物 18S rDNA（520 bp）的 PCR 擴增中，所有來自不同輸入量（5 毫克至 50 毫克）的 DNA 都成功擴增。擴增結果還表明，擴增程度隨著樣品質量的增加而增加，表明儘管麵粉樣品中澱粉含量高，但 DNA 質量仍然很高（圖 2）。因此，Norgen 的植物/真菌 DNA 分離試劑盒能夠從加工過的小麥麵粉中分離出微量的高品質 DNA。

圖 2. 使用 Norgen's Plant/Fungi DNA Isolation Kit（植物/真菌 DNA 分離試劑盒）從不同數量的小麥粉中分離出 DNA 樣品進行終端 PCR 後的 18S rDNA 擴增子。NTC = 無模板對照。

結論

Norgen的植物/真菌DNA分離試劑盒用途廣泛，可從多種植物樣品中分離出DNA。該試劑盒的靈敏度也很高，它可以分離出微量的 DNA，這些 DNA 可能無法通過凝膠電泳直觀檢測到，但可以用於 PCR 等下游應用。因此，我們的試劑盒適用於分離高品質的 DNA，以用於檢測加工食品（如油和麵粉）的基因真偽，這些食品可能含有成分改變且幾乎無法追蹤的 DNA 量。

參考資料

1. Muzzalupo I, Perri E. 2002. Recovery and characterisation of DNA from virgin olive oil. European Food Research and Technology. 214(6):528-531. https://doi.org/10.1007/s00217-001-0482-x

2. Bracci T, Busconi M, Fogher C, Sebastiani L. 2011. Molecular studies in olive (Olea europaea L.): overview on DNA markers applications and recent advances in genome analysis. Plant Cell Rep. 30(4):449-462. https://doi.org/10.1007/s00299-010-0991-9

3. Trantakis IA, Christopoulos TK, Spaniolas S, Kalaitzis P, Ioannou PC, Tucker GA. 2012. Quantitative Bioluminometric Method for DNA-Based Species/Varietal Identification in Food Authenticity Assessment. J. Agric. Food Chem.. 60(4):912-916. https://doi.org/10.1021/jf203531h

4. 2006. Institute of Shortenings and Edible Oils. . Foods, Fats and Oils..

5. 2013. Reuters. Unapproved Monsanto GMO Wheat Found in Oregon. .

6. Zhang L, Wang B, Pan L, Peng J. 2013. Recycling Isolation of Plant DNA, A Novel Method. Journal of Genetics and Genomics. 40(1):45-54. https://doi.org/10.1016/j.jgg.2012.10.001

7. And RT, Lain O. 2005. DNA Extraction from Olive Oil and PCR Amplification of Microsatellite Markers. 70(1):C108-C112. https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.2005.tb09011.x