利用頂空 SPME 和 GC-MS 驗證康普茶中酒精含量的簡單方法

Katherine K. Stenerson, Analytical Sciences Liaison

Merck

Article from Analytix Reporter - Issue 8

Abstract

使用專門為此應用開發和驗證的 SPME 方法分析各種不同 Kombucha 茶的乙醇含量。

簡介

昆布茶是一種發酵茶飲料。它是在糖和茶的溶液中加入酵母和醋酸菌（有時稱為 「茶菌」）的混合物而製成的。經過發酵後，會產生一種含酚、水溶性維生素、有機酸以及一些酒精（乙醇）的泡騰溶液。^1,2

在美國，為了讓 Kombucha 能夠作為無酒精飲料銷售，酒精含量必須為 <0.³ 頂空氣相色譜 (HS-GC) 是一種可輕鬆分析各種水基基質中乙醇含量的技術。就 Kombucha 茶而言，其中可能含有各種甜味劑和調味成分，頂空可用於隔離揮發性酒精與樣品中的其他成分，從而保護 GC 系統。傳統的頂空分析通常需要 GC 以外的儀器。頂空固相微萃取 (HS-SPME) 是分析 Kombucha 等飲料中酒精含量的另一種方法。這項技術可以手動或自動執行，不需要在 GC 外部使用獨立的濃縮器或頂空分析儀，而且與其他更傳統的方法相比，通常執行速度更快，成本更低。

在這項工作中，我們開發了一種 HS-SPME 方法，用於測定 Kombucha 中的酒精含量。我們使用 GC-MS 來進行準確的確認測定。

實驗流程

最終優化的 HS-SPME/GC-MS 方法如 表 1 所述。在去離子水中製備酒精校準標準，濃度為 0.10、0.40、0.80、1.00、1.50 和 2.00 的酒精濃度 (% ABV)，方法是將等分的 200 proof 乙醇直接稀釋於 25 mL 水中。將純乙醇-d6 直接稀釋於含有 25% 氯化鈉的 0.05 M 磷 酸鈉緩衝溶液 (pH=7) 中，製備出濃度為 0.08% ABV 的內標/樣品稀釋液。此溶液用於 SPME 前的樣品稀釋。內標準/稀釋液每日製備，並在使用前冷卻。

所有測試的 Kombucha 樣品都是在當地雜貨店購買的，並在分析前冷藏保存。在方法驗證過程中，使用了酒精含量極低的薑味 Kombucha 來製備加標品。

表 1. 最佳化的 HS SPME-GC-MS 方法

Sample/Matrix:	400 µL 茶樣 + 3.6 mL 鹽/緩衝溶液 (0.05 M Na2HPO4 at pH 7 w/25% NaCl), 含乙醇-d6 (I.S.) 0.(0.05 M Na2HPO4 at pH 7 w/25% NaCl) containing ethanol-d6 (I.S.) at 0.08% ABV in 10 mL headspace vial
SPME Fiber：	聚二甲基矽氧烷 (PDMS)，100 µm 薄膜，23 ga (57341-U)
培養：	7分鐘，40 °C，250 rpm攪拌
萃取：	2分鐘，頂空，40 °C，250 rpm攪拌
解吸過程：	3分鐘，250 °C，分離10：
纖維後烘烤：	5分鐘，260 °C
柱：	SUPELCOWAX® 10, 30 m x 0.25 mm I.D、0.50 µm (24284)
Oven：	40℃（5分鐘），8℃/分鐘至70℃，20℃/分鐘至250℃（5分鐘）
載氣：	氦氣，1 mL/分鐘，恆定流量
探測器：	MSD，全掃描，m/z=25-300（m/z=45用於乙醇定量，m/z=49用於ISTD）
MSD 介面：	250℃
注入：	SPME，10:1 分流
內襯：	0.75 mm 內徑 SPME

結果與討論

HS-SPME 程序的優化

SPME 是一種非常靈敏的技術，通常應用於測試含量非常低的分析物質。此方法的目標分析範圍為 0.10 至 2.00% ABV，對 SPME 而言，此範圍被視為濃度過高。因此，我們的目標是開發一種 SPME 方法，可以在整個範圍內使用，並具有高準確性和可重複性。為了防止纖維和檢測器負荷過重，在 SPME 纖維解吸附過程中，樣品稀釋和使用 10:1 的分離是必要的。

然而，在整個 分析範圍內無法獲得線性響應。圖 1顯示了使用 Carboxen^®/PDMS 纖維和 100 µm PDMS 纖維的 GC-FID 在 0.10 到 1.00% ABV 範圍內絕對響應的比較。使用 PDMS 纖維時，在此範圍內的線性稍好，這從較高的相關係數 (r²) 值可以看出。此外，使用 Carboxen^®/ PDMS 纖維所獲得的反應曲線在 0.80 到 1.00% ABV 之間開始出現一些平移，預期在更高的濃度下會變得更明顯。由於使用 PDMS 纖維能獲得足夠的靈敏度，因此選用它來進行進一步的工作。選擇纖維後，在方法開發過程中評估了其他參數，如萃取溫度、時間、樣品添加劑和樣品稀釋。所有參數都經過優化，以盡量減少水和 Kombucha 茶樣本中酒精反應的變異性。在最終的方法中，乙醇反應不受樣品基質的影響。因此，可以根據乙醇在水中的校準曲線對樣本進行定量。

圖 1. 比較 HS-SPME 與 100 μm PDMS 及 Carboxen/PDMS 纖維所得到的水中酒精反應 (GC-FID)。

方法驗證

使用薑味 Kombucha 複製品評估 HS-SPME GC/MS 方法的準確性，添加濃度為 0.10 至 2.00% ABV。在確定方法的檢測和定量限時，使用了加標濃度為 0.1% ABV 的複本。方法的準確性、重複性、檢測和 定量限在表2中總結。對於 Kombucha 加樣，獲得了良好的線性，從 0.10 到 2.00% ABV 的線性相關係數為 0.999。在分析範圍內獲得了 98-100% ABV 的極佳準確度，方法重複性為 <4% RSD。使用 0.1% ABV Kombucha 樣品 (n=8)，計算出方法的檢測限 (LOD) 和定量限 (LOQ) 分別為標準差 (0.003) 的 3 倍和 10 倍。這些計算出來的值通過分析添加了 0.010% 和 0.030% ABV 的 Kombucha 樣品進行實驗驗證。對於每個濃度的 n=5 個加標，LOQ 的準確度為 95%，重複性值為 6% RSD。LOD 的準確度為 83%，重複性為 21% RSD。LOD 的準確度低且重複性差，可能是由於乙醇在此濃度的反應較差，信噪比比 LOQ 低約 2 倍，比 0.1% 的加標濃度低 4.5 倍。如果有必要在 0.01% ABV 時進行定量，可以對方法進行簡單的修改，例如使用無分割 SPME 進樣，以提高乙醇的反應。

表 2. HS-SPME 方法在 0.10 % 至 2.00 % ABV 的 Kombucha 茶中的準確性和重複性 (*n=8)

Spiking Level (% ABV)	Amt. （% ABV）	平均值 （% ABV） (% ABV)	平均值。 （% ABV）	Repeatability % RSD (n=5)	% Accuracy
0.10 (used for LOD & LOQ)	0.011	0.11	0.098	3*	98
0.50	0.011	0.51	0.50	2	100
1.00	0.011	1.00	0.99	1	99
2.00	0.026	1.99	1.96	1	98

經認證的參考物質分析

使用經認證的低酒精度啤酒參考物質和預先製備的酒精水溶液進一步驗證了該方法。表 3中概述了結果。每種方法都在不同的日期進行了多次分析，在某些情況下由不同的分析師使用不同的儀器進行分析。啤酒樣品的每日精確度為 96-101%，水溶液中酒精的每日精確度為 94-103%，所有樣品組的重現性均為 <6% RSD。

表 3. 方法精確度，使用經認證的參考材料確定

認證濃度 (% ABV)	# Instruments/ Analysts	Range (% ABV)	Avg.Amt.測量 (% ABV)
0.51	10	2/2	0.48-0.51	0.50
0.10	4	2/1	0.095-0.11	0。099
0.25	3	2/2	0.24-0.26	0.25
0.51	7	2/2	0.49-0.52	0.51

Analysis of Kombucha Tea Samples

使用最佳化的 HS-SPME/GC- MS 程序測試了來自十個不同生產商的二十個不同 Kombucha 茶樣本（包括一個自製樣本）。所有樣品在購買後均冷藏保存，並在標籤上標示的 "best by "日期前對新開瓶的樣品進行測試。圖 2總結了測試結果。這組樣本中的所有樣品均以 2 或 3 個複本進行分析。為了確定方法在多天內的重現性，我們在兩個不同的日子對八個樣本的子集進行了一式三份的分析。此子集中的樣品酒精含量從 0.39% ABV 到 1.66% ABV 不等。測量變異性以每個樣品的 6 個複本平均值的 RSD 百分比來決定。對於所有樣品，% RSD 為 3%，顯示該方法對於在不同日期分析的不同樣品批次具有良好的重複性（所有其他參數如儀器和分析師均相同）。

圖 2. 使用 HS-SPME 測量 20 種 Kombucha 茶樣品的酒精 (乙醇) 含量 (% ABV)。

結論

所建立的 HS-SPME/GC-MS 方法可用於精確測量 Kombucha 茶樣品中的酒精含量。優化的方法允許在 0.1 至 2.0% ABV 的範圍內進行精確測定；然而，定量限顯示，精確測量低至 0.03% ABV 是可能的。方法的可重複性，經分析八種不同的 Kombucha 品種後，顯示在兩天內進行的重複測量的 RSD 為 <4%。程序中使用的稀釋方法可將基質效應降至最低，因此可將此 HS-SPME 方法用於其他低酒精基質，例如無酒精啤酒和葡萄酒。將 HS-SPME/GC-MS 方法應用於來自 9 家生產商的 20 種不同品種的市售 Kombucha 茶樣品，發現大多數的酒精含量都超過 0.5% ABV。這顯示目前用於測量這些產品酒精含量的方法並不精確，而且/或者儘管冷藏，裝瓶後仍在繼續發酵，導致酒精含量升高。

參考資料

1. Sun T, Li J, Chen C. 2015. Effects of blending wheatgrass juice on enhancing phenolic compounds and antioxidant activities of traditional kombucha beverage. Journal of Food and Drug Analysis. 23(4):709-718. https://doi.org/10.1016/j.jfda.2015.01.009

2. Jayabalan R, Marimuthu S, Thangaraj P, Sathishkumar M, Binupriya AR, Swaminathan K, Yun SE. 2008. Preservation of Kombucha Tea?Effect of Temperature on Tea Components and Free Radical Scavenging Properties. J. Agric. Food Chem.. 56(19):9064-9071. https://doi.org/10.1021/jf8020893

3. Alcohol and Tobacco Tax Trade Bureau, “General Kombucha Information”. [Internet].[cited 07 Aug 2020]. Available from: https://www.ttb.gov/kombucha