培養人類主動脈平滑肌細胞

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• 培養前準備
• Subculturing HAOSMC
• Differentiating HAOSMC
• I.儲存

  冷凍瓶（354-05a, 354-05f）抵達後，請立即儲存於液氮儲存槽*中。

  *從液氮儲存槽中取出冷凍瓶時，請務必戴上面罩和手套。從儲存槽到室內的劇烈溫度變化可能導致冷凍瓶中滯留的液氮爆裂並造成傷害。

人類主動脈平滑肌細胞 (HAOSMC)

II.培養前的準備工作

1. 確保具有 HEPA 過濾層流氣流的 II 級生物安全櫃處於正常工作狀態。
2. 在開始細胞培養工作前，將生物安全櫃的鼓風機打開 10 分鐘。
3. 確保所有血清移液器、移液器吸頭和試劑溶液都是無菌的。
4. 遵循標準的消毒技術和安全規則：

• 請勿用口移液。
• 即使所有菌株的 HIV、乙型肝炎和丙型肝炎檢測結果均為陰性，但在處理人類細胞時，請務必戴上手套和安全眼鏡。
• 在無菌罩中完成所有細胞培養工作。

III.培養 HAOSMC

準備培養 HAOSMC 的細胞培養瓶

1. 從冰箱中取出平滑肌細胞生長培養基(311-500)。
2. 用移液管移取 15 mL*的平滑肌細胞生長培養基 (311-500)到 T-75 燒瓶中(SIAL0641)。

*保持培養基與表面面積的比例為每 5 cm² 1 mL。例如：

• 5 mL 用於 T-25 燒瓶  (SIAL0639) 或 60 mm 組織培養皿  (SIAL0166)。
• 15 mL 用於 T-75 燒瓶(SIAL0641)或 100 mm 組織培養皿(SIAL0167).

B.解凍和移植 HAOSMC

1. 使用適當的眼睛和手部保護措施，從液氮儲存槽中取出低溫保存的 HAOSMC 小瓶。
2. 將小瓶蓋轉動四分之一圈，以釋放可能滯留在螺紋中的液氮，然後將蓋子重新鎖緊。
3. 將小瓶的下半部放入 37°C 水浴中快速解凍細胞，並在解凍過程中密切觀察小瓶。
4. 當小瓶中只剩下少量冰時，從水浴中取出小瓶。不要讓細胞完全解凍。請勿用手觸摸瓶蓋邊緣或小瓶，以避免污染。
5. 用 2 ml 移液管輕輕地移動細胞 5 次，重悬小瓶中的細胞。
6. 將小瓶中的細胞懸浮液（1ml）移入盛有15ml平滑肌細胞生長培養基（311-500）的T-75容量瓶（SIAL0641）中。
7. 蓋上瓶蓋，輕輕搖動，使細胞均勻分佈。
8. 將 T-75 燒瓶放入 37^oC、5% CO₂ 加濕培養箱中。鬆開瓶蓋以進行氣體交換。
9. 24小時後或隔夜換上新鮮的平滑肌細胞生長培養基(311-500)，以去除所有DMSO的痕跡。
10. 隔天換一次平滑肌細胞生長培養基(311-500)，直到細胞達到60%的融合度。
11. 當培養達到 60% 匯合或週末進食時，加倍 Smooth Muscle Cell Growth Medium (311-500)的容量。
12. 當 HAOSMC 培養達到 80% 匯合時，對細胞進行分培。

IV.亞培養 HAOSMC

製備亞培養試劑

1. 從-20 °C的冷凍庫中取出 胰蛋白酶-EDTA溶液 (T3924)和 胰蛋白酶抑制劑 (T6414)，並在冰箱中解凍過夜。
2. 確保所有亞培養試劑均已解凍。輕輕攪拌每瓶試劑數次，以形成均勻的溶液。
3. 將所有亞培養試劑儲存於 4 °C，以備日後使用。
4. 如果只需要一部分 胰蛋白酶/EDTA溶液 (T3924)，請將未使用的部分儲存於-20 °C。

準備培養瓶

1. 從冰箱中取出 平滑肌細胞生長培養基 (311-500)。
2. 用移液管吸取30 mL平滑肌細胞生長培養基 (311-500)到T-175燒瓶 (SIAL1080)中（將用於第四節C步驟15）

1. 從冰箱中取出平滑肌細胞生長培養基 (311-500)。

HAOSMC的分培

室温下胰蛋白酶化细胞。

用 HBSS (H6648)清洗單層細胞，吸出溶液。

用移液管吸取 8 mL 胰酶/EDTA 溶液(T3924)到 T-75 烧瓶(SIAL0641)中。

立即移除 7 mL 溶液。

重新蓋緊瓶蓋，在室溫下倒置顯微鏡下監測胰蛋白酶化的進程。

用手掌拍打瓶側，直到大部分細胞脫落，從培養液表面釋放圓形細胞。

將培養瓶中的細胞懸液移至 50 ml 無菌錐形管中。

用另外 5 mL 的胰蛋白酶抑制溶液 (T6414)冲洗烧瓶，并将溶液转移到同一锥形管中。

在显微镜下检查 T-75 烧瓶 (SIAL0641)。

將圓錐管以 220 x g 離心 5 分鐘，使細胞沉澱。

將上清液從管中抽出，不要打擾細胞沉澱。

用手指輕彈圓錐管的頂端，鬆開細胞團。

將細胞重懸在 5 mL 的平滑肌細胞生長培養基(311-500)中，用移液器輕輕地移動細胞，使其團塊破裂。

使用血球計或細胞計數器計數細胞。快速生長時接種 10,000 cells per cm² ，定期分次培養時接種 6,000 cells per cm² 。

V.分化 HAOSMC

Seeding HAOSMC for Differentiation

1. Seed HAOSMC in Smooth Muscle Cell Growth Medium (311-500)中，以每 cm15,000 個² 的數量培養。
2. 將細胞置於 37 ^oC、5% CO₂ 加濕培養箱中。
3. 第二天換上平滑肌細胞分化培養基(Smooth Muscle Cell Differentiation Medium)(311D-250)，方法是吸出培養組織器皿中的生長培養基，加入適當容量的平滑肌細胞分化培養基(Smooth Muscle Cell Differentiation Medium)(311D-250)。
4. 將細胞培養在 37 ^oC、5% CO₂ 加濕的培養箱中。

分化 HAOSMC 以表达收缩蛋白

1. 从培养组织器皿中抽吸除去 平滑肌细胞分化培养基 (311D-250)。
2. 加入適當容量的 平滑肌細胞分化培養基 (311D-250)。
3. 將細胞置於37 ^oC，5% CO₂ 加濕培養箱中的 平滑肌細胞分化培養基 (311D-250)中培養。
4. 每隔一天換上新鮮的 平滑肌細胞分化培養基 (311D-250)。
5. HAOSMC在10天後生長停止，平滑肌a-動蛋白表達。