細胞培養中的鈣

Dennis R. Conrad, PhD

• 為什麼要在細胞培養中使用鈣？
• 鈣在細胞培養基中的主要功能
鈣的化學特性使其成為有用的無血清培養基添加劑

鈣在 無血清 真核細胞（包括雜交瘤和中國倉鼠卵巢（CHO）細胞培養）中的重要性和用途。

鈣是一種離子上穩定的二價陽離，在細胞 培養基中具有有益和有毒的特性。

經典培養基及其衍生物中的鈣濃度各不相同，從用於培養軟骨胚胎骨的 BGJb Medium Fitton-Jackson Modification 中的 0，到用於培養附著細胞系 Chick Embryo Fibroblasts 的 MCDB media 201 中的 2 mM。一般而言，血清補充的鈣濃度最高，例如 FBS,  為附著細胞類型開發的經典培養基 。血清通常可保護細胞免受氧化損傷。在無血清培養基以及為原代和克隆細胞培養而開發的培養基中，鈣含量通常較低。這可能是由於原代細胞和以克隆密度生長的細胞容易受到氧化過程破壞的細胞膜的毒性鈣流入所致，在 無血清 培養基，以及酵素和機械處理。由於鈣會影響細胞信號傳導、分化以及細胞附著，因此針對特定細胞類型開發的培養基可能需要大幅降低鈣含量。

以下 經典培養基 含有1.8 mM 鈣：Basal Medium Eagle (BME); CMRL-1066 Medium; Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM); Glascow Minimum Essential Medium, GMEM; H-Y Medium (Hybri-Max^®); Medium 199；Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)；NCTC Medium；Swim's S-77 Medium；and Williams Medium E.Click「s Medium；MCDB 培养基 131 和 Iscove」s Modified Dulbecco「s Medium (IMDM) 含钙量稍低，分别为 1.67、1.60 和 1.49 mM.

L-15 培养基和 Ames」 Medium 含钙量分别为 1.26 和 1.15 mM的鈣。

DMEM/Ham's Nutrient Mixture F-12 (50:50)經常被用作開發專有和 特殊培養基 的基礎培養基，以培養生物製造中的CHO細胞。這種培養基含有 1.05 mM 的鈣，非常接近 MCDB 培養基 105 和 110 中 1.0 mM 的鈣含量。MCDB 培養基專為人類二倍體細胞的克隆生長而開發。其他 經典培養基 如Nutrient Mixture Ham's F-12 Kaighn's Modification（F12K）（0.92 mM）；McCoy's 5A Modified Medium（0.9 mM）和Waymouth Medium MB（0.82 mM）也含有接近1 mM的鈣。

MCDB medium 302 developed for CHO cells contains 0.60 mM calcium.Nutrient Mixtures、Ham's F-10和F-12；以及 Serum-Free/Protein Free Hybridoma Medium（以F-12為基礎）均含0.30 mM鈣。RPMI-1640 含 0.42 mM 鈣。用於 CHO 培養的培養基的鈣濃度範圍為 0.30 至 1.05 mM。含 1.05 mM 鈣的 DMEM//F-12 (50:50) 培養基更常被用作生物製造中使用的 CHO 培養基的開發基礎。

為角質形成細胞開發的 MCDB 培養基 151 和 153 含有 0.03 mM 範圍內非常低的鈣。用於角質形成細胞的極低鈣含量揭示了鈣可能對特定細胞類型具有重要的調節或分化影響。

鈣輸送的管理是生物製造和組織工程的  複雜而重要的要求。不當的鈣管理可能會影響培養細胞的附著、分化狀態及存活能力。有關鈣作為細胞 培養基 添加劑的更完整討論，請參閱下文。 

鈣在細胞 培養基的主要功能

鈣細胞信號傳導

鈣在多個層次上參與受體介導的信號轉導。它能促進蛋白激酶 C 與細胞膜的結合，而當肌醇 1,4,5 三磷酸鹽將其從 ER 中釋放出來時，它會與鈣調蛋白結合並激活鈣調蛋白。環狀核苷酸 cAMP 和 cGMP 具有第二信使的功能。活化的鎮靜劑調節環化酶和磷酸酶，控制細胞內這些核苷酸的池。活化的鈣調節素還能調節參與細胞週期進程的蛋白激酶和磷酸酶

細胞附著和組織形態

鈣有助於細胞附著到基底和細胞之間，並介導許多影響細胞移動、形狀和三維結構的細胞事件。鈣可調節黏附蛋白、選擇蛋白和整合蛋白的功能。這些黏著分子家族分別調控同源細胞-細胞、異源細胞-細胞及細胞-基質的互動。

鈣循環

健康的細胞在細胞外和細胞內的鈣之間維持很大的濃度梯度。正常細胞外的鈣濃度為 1-3 mM，細胞內的鈣濃度為 0.1 至 0.2 µM。多種膜轉運通道可調節鈣的平衡，並調節細胞對環境刺激的反應。鈣輸送通道或細胞膜完整性的破壞會導致鈣快速流入。造成細胞膜損傷的主要因素是氧化壓力所引起的脂質過氧化。細胞內的鈣累積會造成一連串的破壞，包括擾亂酵素功能、離子和 pH 平衡，以及改變線粒體等重要細胞器的功能。當膜損傷使細胞內的鈣濃度升高到 0.5 µM 以上時，細胞的線粒體就會開始從胞質中清除鈣。

鈣從胞質轉運到線粒體的過程是由線粒體內膜電位驅動的鈣單向轉運器（calcium uniporter）介導的。這個膜電位是由線粒體基質和線粒體膜間空間之間存在的 pH 差異所建立的。當鈣通過單向通道進入基質時，會降低膜電位。線粒體通常使用數種轉運器將鈣從基質中移除。這些轉運器包括對鈉不敏感的低容量轉運器、鈉/鈣轉運器和高電導相變孔。高電容相變孔可以部分且可逆地打開，也可以完全且不可逆地打開。當線粒體基質鈣含量在細胞訊號傳導過程中急劇增加時，基質鈣濃度的增加會導致高電容孔隙開啟，以進行離子擴散。當這個孔洞開啟時，鈣可以從線粒體基質中逸出，而質子則可以進入基質中。這會導致線粒體內膜暫時去極化。基質內 pH 值的上升會導致高電容孔隙關閉，電子傳輸鏈重新建立膜電位。只有當膜電位重新建立時，ATP 合成才會發生。鈣在線粒體中的循環是對鈣調動刺激的正常且必要的生理反應。它有許多目的。當線粒體內的鈣濃度超過約 500 nM 時，它會迅速將其移除，以緩衝細胞質中的鈣影響。

鈣悖論和細胞凋亡

細胞通常暴露於 mM 濃度的鈣而不會產生毒性後果。當細胞外的鈣從細胞中移除一段時間後，細胞再暴露於鈣時，有時會發生廣泛的細胞損傷和死亡。這個悖論的解釋是：這是在細胞也受到破壞細胞膜的情況下發生的。這種現象通常是在組織缺氧後重新供氧時觀察到的。細胞膜的氧化損傷可能是造成此效應的常見媒介。鈣螯合劑（如 EDTA）經常用於細胞胰蛋白酶化時。胰蛋白酶作用和氧化作用對細胞膜造成的損害，可能會使這些細胞在重新懸浮於含鈣介質中時，容易發生鈣介導的細胞死亡。介質中的鈣濃度通常在 mM 範圍內，而機械或化學損傷對細胞膜造成的破壞可能會導致鈣滲漏至細胞內。一旦細胞內的鈣濃度超過 500 nM，線粒體就會主動吸收。由於細胞外的鈣池很大，線粒體無法重新建立正常的細胞內鈣濃度。當線粒體吸收鈣質時，ATP 合成停止，線粒體內膜去極化，基質 pH 值上升，過量的鈣與膜過渡孔結合，使其完全且不可逆地打開。一旦這個孔完全打開，一連串的事件就會發生，導致細胞凋亡誘導因子和細胞色素 c 的釋放。

鈣的化學特質使其成為有用的&?nbsp;Serum-Free Media Supplement

鈣是一種豐富的二價地球金屬，在自然界中以許多固態的無機形式存在。

鈣在細胞培養中最大的化學問題是其溶解性和生物利用率。 鈣經常以可自由溶解的氯化鈣形式添加到細胞中 。一旦進入溶液，鈣會重新分配並與培養基的其他離子和分子結合。

磷酸钙

磷是细胞培养体系中普遍存在的元素，在某些条件下可能会导致钙沉淀。在生理 pH 值下，無機磷主要以一鹽基和二鹽基磷酸鹽的形式存在。磷酸鈣在冷水中的大致溶解度為：一元磷酸鈣，Ca(H₂PO₄)₂，71mM；二元磷酸鈣，CaHPO₄，1.7 mM 和三鹽基磷酸鈣，Ca₃(PO₄)₂，0.06mM。在 pH 7.0 時，約有 61% 的磷酸鹽以二鹽基型態存在，而在 pH 7.6 時，則增加至約 87%。這種形式的磷酸鈣溶解度約為 1.7 mM，而培養基配方中通常使用的最高濃度為 1.8 mM。這表示只有在進行鹼滴定等活動時，pH 值變為基本時，磷酸離子才會造成鈣沉澱的問題。

螯合劑

檸檬酸鹽和 EDTA 等螯合劑有時會用在細胞培養中。EDTA 與鈣的對數親和值約為 10.6，常用於去除細胞培養液中的鈣，尤其是當細胞脫離基質或細胞結塊成為問題時。檸檬酸鹽和白蛋白與鈣的對數親和係數分別約為 3.6 和 2。檸檬酸鹽也會與白蛋白結合。檸檬酸鹽和白蛋白可在細胞培養系統中結合相當多的鈣。

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