用於螢光細胞標記的 PKH 連接劑試劑盒

PKH Linker Kits for Fluorescent Cell Labeling

特點

• 實現活細胞穩定、均勻、強度高、重複性好的螢光標記
• 長達 100 天的穩定標記
• 無毒性，不影響生物或增殖活性
• 長達 100 天的穩定標記
• 無毒性，不影響生物或增殖活動
• 強度高且易於使用
• 多用途 - 適用於任何類型的細胞
• 細胞間的滲漏或轉移極少

引言

細胞功能和發病機制方面的許多關鍵研究發現都有賴於標記活細胞。要研究個別細胞行為、生長與分化，以及細胞與細胞之間的互動，最重要的是能夠永久「標記」一群細胞，而不影響它們的形態或功能。細胞現象的研究，如黏附、結合物形成、細胞毒性、吞噬、生長促進、存活時間、凋亡和雜交瘤融合，都有賴於可靠、無毒、穩定的細胞標記。

早期的細胞標籤方法使用螢光標籤，例如螢光素、羅丹明、Dil-C₁₈-(3) 或 Hoechst 染料；或放射性標籤，如碘尿苷、111铟氧化物和鉻酸鈉。¹ 有些方法不夠穩定，因此它們會滲漏並轉移到混合群中的其他細胞，混淆結果。其他方法會改變細胞功能或具有細胞毒性，因此會造成與其使用直接相關的實驗假象。最後，這些方法通常會標記弱或不均勻，使得檢測困難，無法設計可靠的標記方案。

PKH螢光細胞連結劑套件避免了這些傳統方法的所有缺點。現在，有一種細胞標記方法是唯一的「最佳方法」，可持續可靠地標記有活力的細胞（表 1）。PKH染料以其發現者Paul Karl Horan命名，是一種已獲得專利的螢光染料和細胞標記技術² ，已成功應用於動物、植物和細菌細胞，甚至是不含細胞膜的微粒。³ 標示的細胞可以在培養和 體內進行研究。雜交瘤等快速分裂的細胞，以及紅血球等非增殖細胞，都能被標示和追蹤。

表 1. 細胞追蹤試劑的特性。縮寫：Dil = 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate; DiO = 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate；CFSE = 羧基螢光素琥珀酰亞胺酯; Biotin-SE = 生物素琥珀酰亞胺酯; GFP = 綠色螢光蛋白; b-Gal = b-半乳糖苷酶

多功能性

PKH細胞標示技術的多功能性歸功於其創新的化學技術。強螢光染料分子附著在長的親脂性尾巴上。

穩定性

這些分子穩定地分離到膜中，允許長期監測，而重要的功能性表面蛋白則沒有改變。事實上，所有細胞功能，從增殖到細胞表面抗原辨識，基本上都不受 PKH 染料標記的影響。

強烈、可重複的膜染色

PKH染料標記方案通常可以優化，使存活的標記細胞超過75%，平均螢光超過背景的1,000倍（圖1）。這種高信噪比在標記增殖細胞系時尤其重要，因為每個子細胞只能得到母細胞一半的標記。使用 PKH 染料，在標記強度接近背景之前，最多可以跟蹤十代（圖 2）。

圖 1. 第零天 PKH26 標示的人體外周血白細胞 (PBL) 的去卷直方圖，顯示未增殖的對照母體群。

圖 2. 以 2.5 μg/mL PHA 活化 6 天的 PKH26- 標記 PBL 中 CD4+/CD45RO+ 子集的去卷直方圖。內圖顯示由光散射及免疫表型所設定的閘門。

PKH染料的特性

有三種不同的PKH染料用於標記細胞 - PKH2、PKH26和PKH67。PKH2 和 PKH67 都是綠色螢光標籤；兩者都可以用裝有螢光素過濾器的顯微鏡和流式細胞儀偵測到。由於它們的發射光譜與紅色區域幾乎沒有重疊，因此非常適合用於細胞毒性研究^4,5 與紅色螢光活力探針（如碘化丙啶 (PI) 和 7-aminoactinomycin D (7-AAD)），以及其他紅色標籤（如 R-phycoerythrin 和 Texas Red）一起使用。

PKH2的 體內 半衰期為5-8天，非常適合中短期研究。PKH67 具有比 PKH2 更長的脂肪族尾部，因此標記更穩定，細胞間轉移更少。以前使用 PKH2 的用戶可能會發現，PKH67 在長期研究和必須盡量減少細胞間轉移的研究中能提供更好的結果。

PKH26 是一種紅色螢光染料。它具有最長的 體內 半衰期（超過 100 天），是 體內 細胞追蹤、細胞增殖研究和其他長期實驗的理想選擇。^7-9 羅丹明或藻紅素 (PE) 濾光片適用於 PKH26 檢測。可使用標準螢光素激發波長，但螢光強度會有所降低。

PKH26與綠色PKH染料互補。在混合細胞群的研究中，它可以不受 PKH2、PKH67 或螢光標記抗體的干擾而被定量（圖 3）。

圖 3. 單核巨噬細胞吞噬惡性淋巴細胞的共焦分析。巨噬細胞（用 FITC 綠色標記）、惡性淋巴細胞（用 PKH26 紅色染色）和雙特異抗體結合後在 37 ℃ 培養。共焦切片在 30、60 和 360 分鐘後進行檢驗，並說明目標結合、攝取和破壞的過程。Ely, P., et al., "Bispecific-armed interferon gamma primed macrophage mediated phagocytosis of malignant non-Hodgkins lymphome," Blood, 87, 3813 (1996)。經許可轉載。

方法

用於一般細胞標示

 體外 一般細胞標示程序可用於單核細胞、巨 噬細胞、淋巴細胞和其他懸浮細胞。生長在組織培養容器表面的細胞可進行原位染色  但可能會產生不均勻染色。若要均勻染色，應先用蛋白質分解處理（如胰蛋白酶 + EDTA）懸浮附著的細胞。

圖 4. PKH 染料標記的標準方案。

圖 4 示意性地表示了該方案。將 23 細胞懸液和 23 染料溶液（兩者均在隨試劑盒提供的 PKH 稀釋液中）混合，並在室温下短暫孵育。加入蛋白質（含血清或 BSA 的培養基）停止標示反應。標示的細胞會被洗滌 3-5 次以去除未結合的染料。

對於吞噬細胞的標示

在非吞噬細胞存在的情況下，可使用另一種稀釋液選擇性地標示吞噬細胞。在這種稀釋液中，染料不會溶解，而是形成微聚集體；這些微聚集體不能嵌入膜中，但可以被吞噬作用攝取。這種方法已被用來研究巨噬細胞和中性粒細胞 在體內的壽命和遷移模式。

若要根據染料稀釋剖面分析增殖，我們建議使用 Modfit 軟體 (Verity Software House, Topsham, ME) 中的 Proliferation Wizard 模組。

摘要

PKH Fluorescent Cell Linker Kits 使用專利的螢光細胞連結技術，將報告分子納入細胞膜中。被標籤的細胞同時保留生物活性和增殖活性，是細胞追蹤和細胞-細胞互作研究的理想選擇。由於染料的非特異性標記，已成功標記各種類型的細胞。 表 2 列出了已成功標記的常見細胞類型， 表 3 列出了許多 PKH 染料的應用。

表 2. 使用 PKH 染料成功標示的細胞類型。

表 3. 使用 PKH 染料監測細胞功能。

參考資料

1. Samlowski WE, Robertson BA, Draper BK, Prystas E, McGregor JR. 1991. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 144(1):101-115. https://doi.org/10.1016/0022-1759(91)90236-9

2. The patented PKH dye technology, developed by Zynaxis Cell Science, is now owned by Phanos Technologies.. [dissertation].

3. Horan PK, Melnicoff MJ, Jensen BD, Slezak SE. 1990. Chapter 42 Fluorescent Cell Labeling for in Vivo and in Vitro Cell Tracking.469-490. https://doi.org/10.1016/s0091-679x(08)60547-6

4. Slezak SE, Horan PK. 1989. Cell-mediated cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 117(2):205-214. https://doi.org/10.1016/0022-1759(89)90142-7

5. Hatam L, Schuval S, Bonagura VR. 1994. Flow cytometric analysis of natural killer cell function as a clinical assay. Cytometry. 16(1):59-68. https://doi.org/10.1002/cyto.990160109

6. Unpublished data, Zynaxis, Inc. [dissertation].

7. Horan PK, Slezak SE. 1989. Stable cell membrane labelling. Nature. 340(6229):167-168. https://doi.org/10.1038/340167a0

8. Yamamura Y, et al.. 1995. new flow cytometric method for quantitative assessment of lymphocyte mitogenic potentials.. Cell Molec Biol. 41(S121):

9. Wallace Paul K. 1993. Mechanisms of adoptive immunotherapy: improved methods for in vivo tracking of tumor-infiltrating lymphocytes and lymphokine-activated killer cells.. Cancer research. 53(10):2358-2367.