氧氣與一氧化氮探針

氧探針

釕(Ruthenium)基複合物已被廣泛用於檢測和定量氧。螢光會被氧強烈淬滅。其優點有

• 壽命長，在 613 nm 附近發光，可將自發光背景降至最低
• 已公佈的應用範圍廣泛
• Ru(dpp)₃(PF₆
• 優異的穩定性和光穩定性

致氟一氧化氮成像探針

致氟探針

NO探針的生物學相關性

一氧化氮 (NO) 在神經元、內皮細胞和免疫系統中扮演主要的訊號傳遞者角色。NO 與血管擴張¹、神經傳遞²、細胞毒性、免疫反應³ 和發炎^4,5,6有關。

在細胞內，一氧化氮合酶 (NOS) 在分子氧、四氫生物蝶呤、NADPH 和黃素輔助物質的存在下，催化精氨酸轉換為瓜氨酸和 NO。N^ε-羥基-L-精氨酸是此反應的中間體。

NO 的半衰期 在體內 只有幾秒鐘⁷，但是，由於它可溶解於水性和親油性介質中，因此很容易在細胞質中擴散並穿過細胞膜。NO 對中樞神經系統的神經傳導以及突觸可塑性都有影響。在血管中，NO 會活化鸟苷酸環化酶，進而增加 c-GMP 的合成，進而誘發平滑肌鬆弛和血管擴張。另一個有趣的方面是 NO 的毒性，它能與超氧陰離子結合形成過氧亞硝酸鹽，這種氧化自由基會破壞 DNA 和其他細胞成分。

由於 NO 的重要性，因此 NO 的即時檢測和定量非常重要。由於 NO 不穩定，而且在生物系統中的濃度可能很低，因此需要高靈敏度和特異性的檢測方法。如果有合適的 NO 探針，基於螢光顯微鏡的高空間-時間解析度 NO 濃度成像似乎是最佳選擇。

致螢光探針

在尋找選擇性 NO 捕集的過程中，我們發現在分子氧的存在下，NO 與苯基、鄰位二元胺的轉換可以設計出敏感的 NO 探針。⁸

弱螢光的鄰位二胺可以在 NO 和 O₂ 的作用下轉換成相應的三唑，導致螢光強度增加。即使不是所有的螢光 NO 探針⁹，大部分都是基於這個機制。2,3-Diamino-naphthalene (DAN, 88461)被確立為測量NO濃度 體外 和生理條件下的靈敏探針¹⁰。在低 nmolar 濃度範圍內可檢測到相關的 2,3-萘並三唑 (NAT)。

圖 1. DAN 和 NAT 分別在激發波長 365 nm（虛線）和 375 nm（實線）時的發射光譜（來自參考資料 9）。

然而，由於 DAN 在載入後會迅速透過細胞膜滲漏，而且其激發/消散波長相當短，會在生物基質中產生高背景螢光，因此 DAN 並非檢測細胞中 NO 的理想選擇。因此，DAN-1（及其可穿透細胞膜的前體 DAN-1 EE）被開發出來⁸。DAN-1 和其與 NO 的螢光反應產物 DAN-1-T 經由細胞酯酶水解 DAN-1 EE 後所形成的 DAN-1，其漏洩行為確實有相當大的改善。

圖 2. DAN-1 螢光強度時程取決於 [NO]（來自參考資料 8）。將 NO 釋放試劑 (a NONOate) (箭頭) 注入 DAN-1 在 pH 7.4 緩衝液中的溶液，最終濃度為 a) 5 μM 和 b) 50 μM，然後在 440 nm 波長、365 nm 激發下測量隨時間變化的螢光強度。

用於活細胞中即時檢測的探針

然而，DAN-1 在活細胞中即時檢測 NO 方面顯示出一些缺點，例如短的激發/誘發波長、細胞毒性、強自發光、消光係數小以及在中性緩衝液中溶解度不足。

為了消除這些缺點，我們開發了 DAF-2 及其可穿透細胞膜的前體 DAF-2-DA^11,12。此探針以廣泛使用的螢光素螢光源為基礎，結合了便利的光譜特性和相當的螢光亮度，在水中也是如此（見表 1）。具有相似消光係數的探針 DAF-2 及其 NO 反應產物 DAF-2 T 的量子產率分別為 0.005 和 0.92，因此結合 NO 會導致螢光增加約 20 倍。

DAF-2檢測NO的極限是5 nM 體外，即在沒有吸收副產物的情況下。NO 的氧化形式，如 NO₂- 和 NO₃-，以及活性氧物質，如 O₂。-、H₂O₂、ONOO- 不會與 DAF-2 反應產生螢光產物，因此在生理條件下，沒有 NO 時不會形成 DAF-2 T。

圖 3. 培養的 DAF-2 DA 載入平滑大動脈大鼠肌肉細胞的螢光反應。

1. 內毒素和細胞活化細胞，1 nM L-Arg。
2. 失活細胞，1 nM L-Arg

光靜電羅丹明發光性NO探針

儘管 DAF-2 具有優異的特性，但它的某些特徵並不理想，例如光穩定性有限、螢光與活體自發螢光重疊，以及在 pH 值低於約 6 的範圍內會失去螢光。Therefore analogous rhodamines have been developed, namely DAR-1 (Product No. 09014), DAR-2 (Product No. 08715）^13,14 其光譜數據如 表 1所示。

選定 NO 探針的光譜特性

表 1.

l abs.[nm]	e[x10 4 M -1cm -1]		l em.[nm]	rel.量子產率
二氨基	三氮唑	二胺	三唑
DAF-2	486	491	7。9	7.3	513	0.005	0.92
DAR-1	550	556	12	8.7	575	0.004	0.25
DAR-2	549	552	10	7.1	571	0.006	0.34
DAR-M	550	558	9.8	7.5	574	0.007	0.29

在 0.1 M 磷酸盐缓冲液 pH 7.4 中 20° 时的数据；量子产率通过与已知的罗丹明 B 的量子产率比较得出。DAR-1和DAR-2的NO反應產物在pH 7左右顯示出輕微的螢光信號不穩定性，這是由於三唑質子的pKa值在7左右。因此，引入了甲基化的類似物，DAR-M ^13,14 (表1 和圖4)。

圖 4. 三氮唑形式的螢光強度與 pH 值有關

表 2. DAF 和 DAR 型探針的比較特性*

	DAF的	DAR's
L ex [nm]	~490	~550
L em [nm]<	高於 pH 4
~10 nM (DAR-M, 體外)
	無光漂白cytosol > nucleus

* 來自 ref. ^12,13,14
** 基於暴露於陽光下 3 小時後的螢光強度測量。

參考資料

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