使用基於聚集誘發發光 (AIE Dot) 納米技術的生物相容性螢光奈米粒子對癌症和幹細胞進行長期活細胞追蹤
Nick Asbrock1, Kevin Su1, Vi Chu1, Bin Liu2
1Assay & Platform Development, Bioscience BU, EMD Millipore, 28820 Single Oak Drive, Temecula, CA, USA 92590, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, National University of Singapore, Singapore
用於細胞追蹤的熒光納米粒子
熒光成像技術具有空間分辨率高、易於獲取、細胞毒性低等優點，已被廣泛用於細胞追蹤和追蹤實驗。 使用綠色/紅色螢光蛋白（GFP/RFP）的螢光報告器已經在這一領域佔據了優勢。然而，它們有許多缺點，包括：不同的基因轉染效率、基因突變和光穩定性差，這導致原代細胞和幹細胞的標籤和追蹤面臨挑戰。幸運的是，細胞滲透性染料的發展提供了一種簡單的直接螢光標籤方法。這些螢光試劑很容易內化成細胞，不會破壞正常細胞活動，並可在增殖和分化過程中高度保留在細胞中。這些標籤試劑具有極高的初始螢光，但容易受到信號淬滅和光漂白的影響。最近，無機半導體量子點被開發成為細胞標籤和追蹤試劑。以量子點為基礎的追蹤試劑具有高發射性和光穩定性，但其內在的重金屬核心可能會導致不良的細胞毒性，而且量子點的螢光閃爍特性也限制了其在超快速掃描中的應用。
在這篇文章中，我們將重點介紹 LuminiCell Tracker™ 螢光奈米粒子在體外 和體內 環境中增強對癌症和幹細胞的長期可視化和追蹤。有別於傳統染料的濃縮或聚集淬火（ACQ），LuminiCell 追蹤器利用具有 聚集誘發發光 (AIE) 特性1,2,3,4,5。這些新的 AIE 細胞追蹤染料已被包裝到細胞可滲透的生物相容性螢光奈米粒子 (AIE Dot)；提供超亮的螢光 (10X)、增強的光穩定性 (3X) 以及長時間低細胞毒性的生物影像應用。
圖 1.LuminiCell Tracker™ 螢光奈米粒子的物理特性。A) LuminiCell Tracker™ 奈米顆粒的製作包括將螢光 TPETPAFN AIE 分子包封在 DSPE-PEG200 外殼中，外殼附有可穿透細胞的 TAT 序列；i) 自組裝和 ii) 生物接合。B) LuminiCell Trackers™ 與商用 Qtracker® 在 37 °C 下於 1X PBS 培養 0 至 9 天的物理穩定性比較。
Materials and Methods for Cell Tracking Using Nanoparticles
Construction of LuminiCell Tracker™ 540 and 670
製造 LuminiCell Tracker™ 540 或 670 需要三個關鍵步驟：AIE 染料的設計與合成、AIE 點的構造以及表面功能化。AIE 染料四苯基乙烯 (TPE) 用於結構調諧和修飾，使 AIE 染料具有綠色和紅色發光。我們既有的有機奈米粒子製造策略用來製造生有表面功能基團的 AIE Dot 奈米粒子 (圖 1)。
細胞標籤和成像
將生長介質中的細胞接種到 8 孔玻璃體上，進行固定和活細胞成像。接種密度的選擇是在過夜培養後提供 60% 到 80% 的融合度。細胞播種後的第二天，以含有稀釋的 LuminiCell Tracker™ 540 或 670 的新鮮生長液取代生長液，培養溫度為 4 nM。然後在 37 ◦C、5% CO2 孵育箱中孵育細胞 4 小時。不同類型的細胞可採用不同的孵育濃度和時間。培養 4 小時後，移除含有 LuminiCell Tracker™ 的培養基，以 1 X PBS 緩衝液洗滌細胞兩次，即可進行活細胞顯像。固定細胞成像時，在室溫下以 4% 甲醛在 PBS 緩衝液中固定細胞 20 分鐘。固定 20 分鐘後，用 PBS 緩衝液沖洗細胞兩次，然後成像。
細胞追蹤
細胞培養於 6 孔板中，CO2 ；37 oC培养箱中，细胞培养基含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（PS）。培養過夜後，移除細胞培養液，用 1XPBS 沖洗細胞兩次。使用新鮮的細胞培養液稀釋 LuminiCell Tracker™ 標籤溶液，以 4 nM 的最終濃度製備標籤溶液。每孔加入 2 mL 標籤液。培養 4 小時後，移除標籤液，以 1×PBS 緩衝液洗滌細胞兩次。用胰蛋白酶採集細胞。將細胞懸浮液以 1500 rpm 離心 5 分鐘，並重懸於新鮮的生長培養液中。將重懸的細胞稀釋並移栽到含有細胞培養蓋玻片的 6 孔板中，進行指定世代的培養。在指定的時間間隔後，用 PBS 緩衝液洗淨選擇的細胞，並用 75% 乙醇或 3.7% 甲醛在 PBS 中固定 20 分鐘。用裱褙介質封住蓋玻片，用螢光顯微鏡或共焦雷射掃描顯微鏡研究螢光影像。
體內追蹤
為了進行體內細胞追蹤示範，用 4 nM LuminiCell Tracker™ 誘導培養 4 小時後的癌細胞被收割並重懸於生長培養基。將細胞懸液 (1 X 106 in 0.1 mL medium) 注入小鼠腹部。在注射後指定的時間間隔後，使用 IVIS® Spectrum Imaging 系統對小鼠進行成像。
LuminiCell Tracker™ 奈米粒子的活細胞成像
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圖 2.使用 LuminiCell Tracker™ 奈米粒子的活細胞成像。LuminiCell Trackers™ 對細胞無毒，與傳統量子點技術相比，能產生更明亮的螢光訊號。HeLa 細胞在 6 孔板中以每孔 500K 細胞的數量培養過夜。 第二天，加入 4 nM LuminiCell Tracker™ 670 或 Qtracker® 655，培養 4 小時，然後在第 1 天成像。
圖 3.血管標籤實驗。LuminiCell Tracker™-540 血管標籤試劑盒可對小鼠大腦和耳朵組織進行體內螢光血管成像。該套件包含不含 TAT 序列的綠色螢光 AIE Dot 奈米粒子。這些奈米粒子可用於對活體組織和動物的血管進行螢光標記，以研究炎症和血管滲漏。
圖 4.使用 LuminiCell Trackers™ 進行體外癌細胞追蹤。為了證明 LuminiCell Tracker™-540 細胞標示套組的能力，將 HeLa 細胞以 4 nM 的濃度與 LuminiCell Tracker™ 540 共孵育 4 小時，之後棄去孵育液，再進一步移殖細胞數天。LuminiCell Tracker™ 540 在培養後第 1 天顯示出非常高的標籤效率，接近 100%，在培養後第 5 天仍高於 90%。在培養後第 10 天，仍可觀察到被標示細胞發出可分辨的螢光，顯示 LuminiCell Tracker-540™ 細胞標示套組具有優異的細胞追蹤能力。
圖 5. 利用 LuminiCell Trackers™ 追蹤體內癌細胞A) 使用 LuminiCell Tracker™-670 細胞標示套件追蹤 MCF-7 癌細胞。B) 小鼠皮下注射 1 × 106 的 MCF-7 細胞，經 2 nM LuminiCell Tracker™ 670 標籤後立即顯示的代表性 體內螢光影像。C) 圖表顯示 21 天追蹤期間腫瘤部位的綜合螢光強度。
監測和了解體內幹細胞的命運對幹細胞治療非常重要。直接細胞標籤技術似乎是最有前途的技術，其中，LuminiCell Tracker™具有極高亮度、優異的光穩定性和通用染色能力，是幹細胞治療過程中染色和可視化幹細胞活動的理想解決方案。使用 LuminiCell Tracker™ 670 作為 標籤 試劑和脂肪衍生 間充質幹細胞 (ADSCs)進行幹細胞追蹤。體外
圖 6. 使用 LuminiCell Trackers™ 進行體外幹細胞追蹤A) AIE 點標籤可增強脂肪間充質幹細胞在體外的長期追蹤 (A) ADSCs 用 AIE 點、PKH26 以及 Qtracker® 655 標籤，然後分別培養 1 天和 5 天。
圖 7. 使用 LuminiCell Trackers™ 進行體內幹細胞追蹤A) 體內長期追蹤 ADSCs。B) 使用含 LuminiCell Tracker™ 670 標籤的 ADSC Matrigel 30 天後，小鼠缺血後肢切片的共焦圖像。C) 用 LuminiCell Tracker™ 670 標示含有 ADSC 的 Matrigel 治療 42 天後的小鼠缺血後肢切片的代表性 CD31 染色 CLSM 圖像，白色箭頭表示黃色或橙色螢光的覆蓋。
結論
LuminiCell Tracker™ 螢光奈米粒子為長期細胞追蹤實驗提供簡單、安全且有效的試劑。LuminiCell 以 AIE 嶄新技術為基礎，利用天然不可預防的聚合優勢，提供具有超高亮度的標籤試劑。LuminiCell Trackers™ 擁有優異的螢光量子產量、高抗光漂白性及絕佳的生物相容性，可搭配大多數螢光顯微鏡及流式細胞儀使用。這裡展示的數據證明了 LuminiCell Tracker 在體外 and in vivo tracking of cell fate and activities by using cancer cells and ADSCs as models, which have shown superior tracking time which cannot be achieved by other direct fluorescence labelling techniques.
。參考資料
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