細胞的免疫螢光標記

抗原是證明抗原存在和亞細胞定位的重要工具。細胞染色是一種非常通用的技術，如果抗原高度定位，可以檢測到細胞中少至一千個抗原分子。在某些情況下，細胞染色也可用來判定抗原的大致濃度，特別是利用影像分析儀。細胞染色可分為四個步驟：細胞製備、固定、施用抗體及評估

第一步，將待染色的細胞附著在固體支撐物上，以便在後續程序中輕鬆處理。這可以用幾種方法來實現：粘附的細胞可以生長在顯微鏡玻片、蓋片或光學上適合的塑料支撐物上。

第二步是固定並透化細胞，以確保抗體能自由接觸到抗原。完美的固定可以固定抗原，同時保留真實的細胞和亞細胞結構，允許抗體無阻礙地進入所有細胞和亞細胞區。常用的固定液種類繁多，正確的方法選擇取決於所檢驗抗原的性質和所用抗體的特性。固定方法一般分為兩類：有機溶劑和交聯試劑。有機溶劑（如酒精和丙酮）可去除脂質並使細胞脫水，同時沉澱細胞結構上的蛋白質。交聯試劑（如多聚甲醛）通常會透過游離胺基形成分子間橋樑，進而形成連結抗原的網路。交聯試劑比有機溶劑能更好地保存細胞結構，但可能會降低某些細胞成分的抗原性，並且需要增加一個滲透步驟，以讓抗體進入標本。這兩種固定方法都可能使蛋白質抗原變性，因此，針對變性蛋白質製備的抗體對細胞染色可能更有用。本文描述了四種不同的固定方法。

細胞染色的第三步驟是將細胞製備物與抗體孵育。

在第四步，也就是最後一步，使用螢光顯微鏡評估染色效果。

試劑和設備

1. 生長在蓋玻片上的培養細胞
2. PBS：0.01M 磷酸緩衝生理鹽水，pH 7.2-7.4 （P3813 or P4417)
3.  
   1. 甲醇，在 -20 °C 下冷卻至少 1 小時（Product No. 32213）
   2. 丙酮，在 -20 °C 下冷卻至少 1 小時（產品編號。 24201）

   或

   1. 3-4%多聚甲醛（產品編號. P6148）於 PBS 中。使用 5N NaOH 及溫和加熱溶解於 PBS 中
   2. 0.5% Triton X-100 (Product No. T9284) 在 PBS 中

   或

   1. 3-4% 多聚甲醛（Product No. P6148）於 PBS 中。溶解於 PBS，使用 5N NaOH 並溫和加熱
   2. 甲醇，於 -20 °C 冷卻至少 1 小時（產品編號： P6148）。 32213。）

   或

   1. PEM緩衝液：0.1M PIPES (Product No.  P8203)、5 mM EGTA (Product No. E4378)、2mM MgCl₂ - 6H₂O (Product No. M0250）。使用 NaOH 溶液使 pH 值達到 6.8
   2. 乙醇，在 -20 °C 下冷卻至少 1 小時（產品編號： M0250）。 270741）
4. 第一抗體

程序

固定
第二抗體的應用
評估

註釋：

1. 此為一般規範。一抗和二抗的最佳稀釋度、細胞製備、對照以及孵育時間需要根據經驗確定，可能需要大量滴定。理想的情況是使用產品資料表建議的一抗。
2. 請參考相應的 SDS 以安全處理所需化學品。

细胞制备

1. 从培养箱中取出细胞。在倒置的光學顯微鏡下檢查，確認所需的外觀。丢弃培养基。
2. 用 PBS 冲洗；去除多余的溶液。

Fixation

固定細胞：

說明了四種不同的固定方法。根據應用（或產品資料表的建議）選擇合適的固定方法。

甲醇-丙酮固定

1. 在冷卻的甲醇中固定，在 -20 °C 下固定 10 分鐘。
2. 移除多餘的甲醇。
3. 用冷卻的丙酮在 -20 °C 下過膠 1 分鐘。

或
多聚甲醛-Triton 固定

1. 在 3-4% 多聚甲醛中固定 10-20 分鐘。
2. 用 0.5% Triton X-100 滲透穩定 2-10 分鐘。

或
多聚甲醛-甲醇固定

1. 在 3-4% 多聚甲醛中固定 10-20 分鐘。
2. 用 PBS 短暫沖洗。
3. 在 -20 °C 下用冷卻的甲醇滲透穩定 5-10 分鐘。

或
PEM-乙醇固定

1. 在 PEM 緩衝液中固定 10 分鐘。
2. 在 -20 °C 下用冷卻乙醇滲透穩定 5-10 分鐘。

用 PBS 洗三次（每次至少 5 分鐘）。

Application of Primary Antibody

1. 用 PBS 稀釋一抗至適當稀釋度。塗在細胞上的蓋玻片上，室溫孵育 60 分鐘（建議使用加濕室）。
2. 用 PBS 洗三次（每次至少 5 分鐘）。

Application of Secondary Antibody

注意： 第二抗體僅應用於間接分析。

1. 用 PBS 稀釋標記的第二抗體至適當的稀釋度。
2. 用 PBS 洗三次（每次至少 5 分鐘）。

Evaluation

1. 用裱褙介質裱褙蓋玻片，然後倒轉到玻璃載玻片上。
2. 在顯微鏡下觀察。
3. 記錄結果。

注意： 建議進行適當的陰性對照。陰性對照可建立一抗和二抗的背景螢光和非特異染色。理想的陰性對照試劑是螢光誘導的小鼠單株抗體或骨髓瘤蛋白。陰性對照試劑應該是同型配對、對研究物種的細胞沒有特異性，且濃度與測試抗體相同。自發螢光或陰性對照試劑螢光的程度會因研究細胞的種類及所用儀器的靈敏度而異。若要對帶有 Fc 受體的細胞進行螢光分析，必須使用同型匹配的陰性對照試劑。

參考資料

1. Giloh H, Sedat J. 1982. Fluorescence microscopy: reduced photobleaching of rhodamine and fluorescein protein conjugates by n-propyl gallate. Science. 217(4566):1252-1255. https://doi.org/10.1126/science.7112126

2. Storz H, Jelke E. 1984. Photomicrography of weakly fluorescent objects ? employment of p-phenylene diamine as a blocker of fading. Acta Histochemica. 75(2):133-139. https://doi.org/10.1016/s0065-1281(84)80048-3

3. Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Larboratory Press.

4. Johnson G, Davidson R, McNamee K, Russell G, Goodwin D, Holborow E. 1982. Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy. Journal of Immunological Methods. 55(2):231-242. https://doi.org/10.1016/0022-1759(82)90035-7

5. Longin A, Souchier C, Ffrench M, Bryon PA. 1993. Comparison of anti-fading agents used in fluorescence microscopy: image analysis and laser confocal microscopy study.. J Histochem Cytochem.. 41(12):1833-1840. https://doi.org/10.1177/41.12.8245431

6. Beesley J. 1993. Immunocytochemistry: A Practical Approach. Oxford University Press.

7. Bullock G, Petrusz P. 1989. Techniques in Immunocytochemistry. 1. Academic Press.