含 Stericup^® 快釋過濾器的 PES 膜的幹細胞測試

摘要

儘管微孔過濾是制備細胞培養基及試劑並將其污染減至最低的首選方法，但仍有人擔心過濾步驟會去除有價值的因子及/或在生長培養基中添加有害成分。這種憂慮對幹細胞培養尤其真確，因為幹細胞培養的因子可能很昂貴，細胞可能對添加劑非常敏感，而且培養時間可能非常長。在此，我們展示了含有Stericup^® Quick Release過濾器的PES膜，即使經過許多多重過濾步驟，也能為胚胎幹細胞的多能擴展提供無後顧之憂的替代方案。

背景

在細胞培養過程中，保持無菌是非常重要的；因此，我們需要非常小心地防止污染。

; 液體試劑的滅菌通常使用幾種方法，包括高壓滅菌和微孔過濾。高壓滅菌有許多限制，因為它不能用於含有熱標籤成分（如蛋白質和其他生長因子）的液體生長介質，而且用於其他更基本的緩衝液也很費時。

透過孔徑為 0.2 μm 或更小的膜過濾，可有效去除包括細菌、霉菌和酵母菌在內的污染物。有幾種過濾材料通常用於液體成分的滅菌，包括尼龍、聚碳酸酯、醋酸纖維素、聚偏二氟乙烯 (PVDF，Durapore^® 膜) 和聚醚砜 (PES)。這些過濾材料在蛋白質保留率、流速和可浸出物質的存在方面有很大差異。PVDF 和 PES 都是不含可浸出物的低蛋白結合材料，在過濾生物液體方面有廣泛的應用。

由於細胞培養基對昂貴因子的定義越來越明確，而且細胞培養的時間越來越長，因此過濾以保證無菌和保留重要因子的需求比以往任何時候都更加重要。  此外，過濾不得滲漏任何可能有毒或造成其他有害影響的物質到培養基。這對幹細胞培養尤其如此，因為幹細胞培養對長期多能維持和分化程序的培養基的生長因子濃度非常敏感。基於這些原因，一般的做法是在培養基無菌過濾後加入這些因子，因為擔心這些因子會被移除。

本研究調查了多能胚胎幹細胞擴展所需的生長因子在多次無菌過濾後的保留情況。雖然培養基使用前通常只過濾一次，但我們發現Stericup^® Quick Release過濾器可用於多次過濾培養基（通過新過濾器最多可連續過濾十次），而不會去除重要因子或添加有害物質。這一觀察可以通過定量檢測白血病抑制因子（LIF，小鼠胚胎幹細胞或 mESCs 維持多能性所需的因子）的保留，作為通過 PES 膜 Stericup^® 快釋濾器裝置多次過濾的功能來顯示。此外，透過低密度菌落的適當菌落形態以及多能性標誌物的免疫組織化學分析，可顯示 mESCs 在多重過濾的培養基中保持適當擴展達五次的能力。

結果

白血病抑制因子（ESGRO^®，mLIF培養基添加劑）已被證明是在不使用小鼠胚胎纖維母細胞飼料層時，維持小鼠胚胎幹細胞未分化狀態的關鍵培養基添加劑。我們測試了Stericup^® Quick Release過濾裝置與PES膜在過濾器滅菌期間的LIF保留率。

ESGRO^® media supplement containing media was filed through multiple new PES Stericup^® Quick Release filters.  每次過濾的培養基樣本都被保存下來，以進行保留測試和維持多能擴展的能力。

在LIF濃度的線性反應範圍內，使用LIF特異性夾心ELISA測試（R&D Systems），根據試劑盒說明確定相對的LIF保留。所有樣本均以未過濾的培養基作為 100% 對照，進行一式兩份的測試。此外，還加入了缺乏 LIF 的培養基作為陰性對照，以確定背景。通過與標準曲線比較來確定樣品濃度。對於 3 批過濾器，結果（圖 1）顯示，經過 PES Stericup^® Quick Release 過濾器的 10 個過濾步驟後，約 90% 的 LIF 被保留下來，每次過濾的損失率約為 1%。

對樣品進行了功能測試，以確保多次過濾不會影響LIF的活性或向培養基添加有害的浸出成分。500 mL 的培養基存量各過濾一次，或通過連續的新 PES 過濾器過濾 10 次。每個過濾點測試三批 PES Stericup^® Quick Release 過濾器，共有 6 種存量。在五次傳代後，mESC菌落通過鹼性磷酸酶染色和Oct-4（多能性的轉錄因子標記）免疫組織化學分析來觀察多能性。在所有測試的培養基（不同批次的 PES-Stericup^® Quick Release 過濾器，過濾一次或十次）中以低密度擴展和傳代的培養物都顯示出多能擴展的菌落形態，以及表達適當水平的多能性標記鹼性磷酸酶（圖 2）和 Oct-4（圖 3）

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圖 1.白血病抑制因子 (LIF) 在通過新型 PES 膜 Stericup^® 快速釋放過濾單元進行多次連續過濾時的保留率。 含 ESGRO^® 補充劑的處理培養基的 LIF 濃度，在預定的線性反應範圍內，用三明治式 ELISA 分析法來測定。百分比以未過濾的培養基為 100%。

圖 2. mESC菌落的鹼性磷酸酶染色。mESC菌落培養在0.1%明膠塗層的固底塑料板上，培養基用PES-Stericup^®快釋過濾器過濾一次（a）或5次（b）。用 PBS 中的 3.7% 甲醛固定菌落 2 分鐘。在每個孔中加入萘酚/快驗紅紫溶液，培養 15 分鐘後用 TBST 緩衝液沖洗。

圖 3. mESC菌落的免疫細胞化學分析。mESC菌落培養在0.1%明膠塗層的固底塑料板上，培養基過濾一次（a）或5次（b）。用 3.7% 甲醛固定菌落，並用 0.1% 皂素透化。使用抗 Oct-4 一抗測定 Oct-4 的表達，再使用 Cy3 結合的二抗觀察。