使用 Millicell^® Cell Culture Inserts 的細胞遷移和入侵測試指引

• 執行細胞移動/入侵試驗需要什麼？
• 移動和侵襲試驗樣本協議
• 移動和侵染試驗提示和技巧
• 參考文獻

遷移和入侵試驗概述

細胞遷移是細胞在化學（如化學吸引劑）或機械刺激下的定向移動。它是細胞的重要特性，對細胞發育和傷口癒合等正常過程至關重要。¹在細胞生物學中，遷移和侵襲試驗早已被用來研究腫瘤轉移，其中最常見的試驗是基於Boyden試驗系統。此系統由 Boyden 博士於 1962 年首次使用，他在此展示了使用 Millipore^® 多孔膜進行化學引導。²

今天，遷移實驗可以使用以 Boyden 分析系統為基礎的 Millicell^® 懸掛式細胞培養插入物來進行，而侵襲實驗則需要在膜上塗上 ECM 凝膠，例如 Matrigel^®，然後將細胞接種在上面。這層塗膜可作為細胞入侵時穿透的屏障。

Boyden室系統使用一個中空的塑料室，一端用多孔膜密封。該腔室懸浮在一個較大的孔上，孔中可能含有培養基和/或化學吸引劑。將細胞加入插入的膜頂端（頂部）之前，先用無血清培養基清洗，以確保去除所有血清。含有相關化學引導劑的培養基（如、Fetal Bovine Serum, various cytokines etc.) is added to the wells below the inserts (along with a negative control where no chemoattractant is in the media), and the cells are left in a 37°C CO₂ incubator for the desired amount of time.

孵育後，從膜頂端輕輕移除未遷移的細胞，並使用細胞染色和成像來量化膜基側的遷移細胞。

圖 1. 侵襲試驗原理。將細胞接種於膜頂端的 ECM 塗層插入物中，同時在細胞培養板中加入含有相關化學吸引劑的培養基。將培養板放置所需時間（如 24 小時），讓細胞侵入膜的基側。用棉花棒移除未入侵的細胞，並在成像和計數前對入侵的細胞進行固定和染色。對於遷移實驗，只需省略 ECM 包覆步驟即可。

進行遷移/侵襲試驗需要什麼？

• Millicell^® 细胞培养插片（请参阅下面的插片选择）
• 细胞外基质（e.g.康寧^® Matrigel^® 基底膜基質）

Selecting the Right Pore Size for My Cell Migration/Invasion Assay

插入片的孔徑大小取決於您的實驗中要使用的細胞類型。對於較小的細胞類型，孔徑不能太大，這點很重要，但孔徑也不能太小，以至於遷移性細胞即使在有化學吸引劑的情況下也無法通過。表 1 列出了根據文獻選擇的移動性和侵襲性細胞類型的膜孔尺寸建議。

表 1. 細胞培養插入膜孔徑和伴生化驗。

應用程式 應用	細胞類型	孔尺寸 (µm)
Migration 化學遷移細胞遷移 適應遷移細胞遷移 Boyden室實驗	Endothelial3-4,8, HUVEC6-7、HMVEC5-6	3.0, 8.0
	Neutrophils9-12, PMNs12	3.0
	淋巴細胞9,1314-15, 單核細胞16-17	3.0, 5.0
	18,19	3.0
	17,20-22	3.0, 5.0, 8.0
	23-25	3.0, 8.0
	3.白細胞12,13,26,27	3.0, 5.0
	8.0
侵襲 腫瘤侵襲 血腦屏障 血液/循環	黑色素瘤31-33	8.0
	神經膠質瘤 淋巴瘤, Jurkat38	8.0
	Osteoblasts39,41-43	5.0, 8.0
	8.0
	3.0, 8.0

Millicell^®懸掛式細胞培養插片有多種與遷移和侵襲試驗相容的選項（如表 2 所示）。所有插入物均獨立泡罩包裝，適用於標準組織培養板。

表 2. Millicell^® 用於移動和入侵試驗的細胞培養插入物。 PET 膜經過組織培養處理，可促進細胞附著和生長。

說明說明	薄膜區域	Optical Property	Pore Size	孔密度 (孔/cm2)	Cat.No. (48/pk)
Millicell® 24 孔插件	0.3 cm2	半透明	3.0微米 5.0 微米 8.0 µm	2 × 106 6 × 10 2 × 105	PTSP24H48 PTMP24H48 PTEP24H48
Millicell® 12 孔插件	1.1 cm2	半透明	3。0 µm 5.0 µm 8.0 µm	2 × 106 6 × 10 2 × 105	PTSP12H48 PTMP12H48 PTEP12H48
Millicell® 6 孔插件	4.5 cm2	半透明	3。0 µm 5.0 µm 8.0 µm	2 × 106 6 × 10 2 × 105	PTSP06H48 PTMP06H48 PTEP06H48

移動和侵襲試驗優化

1. 插入物選擇：請參閱上述「選擇用於移行和侵襲試驗的 Millicell^® Cell Culture Insert」一節。
2. 細胞播種密度：針對您的特定細胞株優化接種密度非常重要。如果濃度太高，細胞就很難計數，也可能使膜上的孔過於飽和。加入的細胞太少會導致計數和結果不一致。
3. 誘導劑濃度：優化您感興趣的化學誘導劑是很重要的一步，尤其是當您使用的細胞株與化學誘導劑之間的互動關係之前沒有任何已發表的資料時。在這種情況下，使用幾種不同的趨化吸引劑系列稀釋液來執行實驗會很好。不同類型細胞的反應會因所用的化學引導劑而異。對於研究良好的化學誘導劑，例如 FBS，在您最佳化播種密度時，10% 的血清濃度是一個很好的起點。
4. 定時：優化遷移實驗的孵育時間非常重要，因為最合適的孵育時間取決於細胞類型和所用的化學引導劑（通常，16-24 小時是一個很好的起點，但有些細胞系可能需要更長的時間）。
5. 細胞染色與計數：當您想要對移動的細胞進行成像與計數時，可以使用幾種不同的染色方法。這些方法包括水晶紫（整個細胞染色）和 DAPI 染色（細胞核染色）。固定和染色後，可使用倒置顯微鏡觀察和量化細胞。
6. 媒體容量： Millicell^® 懸掛式細胞培養插片與大多數組織培養板相容。由於不同品牌的孔尺寸可能略有不同，因此最佳做法是優化孔中所需的培養基用量，使其達到與插入物本身中的培養基用量相同的水平。對於 24 孔的格式，良好的起始點是插入物內 100 µL，孔內 600 µL，或插入物內 200 µL，孔內 900 µL。

移動和侵襲試驗樣本協議--播種密度的最佳化

材料：

• 高移動性/侵襲性細胞系，例如、NIH 3T3 cells
• 低遷移性細胞株，例如、MCF-7 cells
• Millicell^® Cell Culture Inserts, 8 μM PET, 24-well
• Trypsin-EDTA solution
• EDTA 0.02% solution in D-PBS
• Corning^® Matrigel^® Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix
• 包被緩衝液
  • 0.01M Tris (pH 8.0)
  • 0.7% NaCl

• HT 1080 & MCF-7非典型培養基/對照培養基（無血清）
  o   EMEM
  o   50 units Penicillin / 50 µg/mL Streptomycin
  o   2 mM L-glutamine
  o   Non-Essential Amino Acids

• HT 1080 & MCF-7 培養基/HT 1080 & MCF-7 培養基。/u>基質試驗培養基（10% FBS）
  o   EMEM
  o   50 units Penicillin / 50 µg/mL Streptomycin
  o   2 mM L-glutamine
  o   10% FBS

• NIH 3T3 培養基（10%小牛血清）
  o   DMEM
  o   50 units Penicillin / 50 µg/mL Streptomycin
  o   2 mM L-glutamine
  o   10% 小牛血清

• NIH 3T3 非典型培養基/對照培養基（無血清）
  o   DMEM
  o   50 units Penicillin / 50 µg/mL Streptomycin
  o   2 mM L-glutamine

• NIH 3T3 基側試驗培養基（10% FBS）
  o   DMEM
  o   50 units Penicillin / 50 µg/mL Streptomycin
  o   2 mM L-glutamine
  o   10% FBS

侵襲試驗的塗佈規範

1. 等分並將 Matrigel^® 儲存於 -20°C。
2. 用冷凍的塗佈緩衝液稀釋 Matrigel 至最終濃度 200 µg/mL，製備塗佈溶液。輕輕攪拌混合物，冰凍保存直至繼續使用。
   • 提示：
3. 使用無菌鉗子，將所需數量的 Millicell^® 懸掛式插入物放入 24 孔組織培養板中。
4. 小心地移取 100uL 包衣液至插入物頂端中央，然後在不搖動的情況下，將封閉的平板在 37°C 下培養 2-3 小時。一旦完成，請務必快速執行接下來的步驟，以避免凝膠乾涸。

第一天：將細胞接種到細胞培養插片上

1. 細胞從細胞培養瓶中脫離，並重悬在含有血清的培養液中以中和胰蛋白酶。
2. 在無血清培養基中清洗細胞兩次，以確保去除所有血清。
3. 在無血清培養基中對細胞懸浮液進行計數並逐次稀釋至所需濃度。
4. 使用無菌鉗，將細胞培養插片從包裝中取出並放入培養板孔中。如上文所述，進行侵襲試驗時，使用包覆 ECM 的細胞培養插片。
5. 將細胞接種到插入物的內側，膜的頂端一側（每個細胞懸液 100 µL）。
6. 在孔中每個插入物的基側加入 600 µL 分析培養基。這種培養基含有 10% FBS，作為一半平板上測試樣品的化學吸引劑，而另一半平板上則使用無血清培養基作為對照。每個播種密度使用三個重複，分別為培養基含有和不含 FBS。 不含細胞的插入物作為空白對照。

第 2 天：遷移細胞的評估

1. 從 24 孔板的孔中移除培養基。方法是用濕潤的棉花棒小心地以順時針和逆時針方向在插入物上旋轉幾次。非常重要的是，您要小心不要損壞膜。
2. 將細胞固定在 4% 多聚甲醛中 10 分鐘，然後用 PBS 洗兩次。
3. 用 0.1% Triton X-100 滲透細胞 10 分鐘，然後用 PBS 洗兩次。
4. 然後用 1 µM DAPI 溶液染色細胞 15 分鐘，然後用 PBS 洗一次。
5. 在 24 孔板的孔中加入 900 µL 分子級水，在 24 孔板內的插入物頂端加入 200 µL 分子級水。  
6. 使用 10 倍物鏡直接從 24 孔板上的 DAPI 濾鏡對插入物成像。重要的是要保持樣品之間的圖像設置一致。  
7. 獲得圖像後，在每個插入物的四個視場中計算移動的細胞。在成像前，在 24 孔板的孔中加入 900 µL PBS，在 24 孔板內的插入物頂端加入 200 µL 分子級水。

如果需要，可以保存樣本並重新染色。插片可儲存於 4 °C 的分子級水中。

圖 2. 24 孔板布局示例，用於優化細胞遷移試驗（或侵染試驗，如果使用 Matrigel^® 塗層插入物）的播種密度。

樣本遷移 和侵襲試驗數據

遷移和侵襲試驗如上節中所述進行。在這些 24 小時遷移試驗之後，對三種細胞株（HT 1080、NIH 3T3 和 MCF-7）加和不加 10% FBS，進行水晶紫染色。HT 1080 細胞具有侵襲和遷移能力，NIH 3T3 細胞僅在本實驗概述的條件下具有遷移能力，而 MCF-7 細胞無法透過孔隙向化學吸引物遷移。

圖 3. 24 小時後，在不同播種密度下，加入或不加入 10% FBS 及 Matrigel^® (200 µg/mL)，膜基側移動細胞（A - HT1080，B - NIH 3T3，C - MCF-7）的水晶紫染色。代表圖片來自每個播種密度下一個插入複製品的一個視野。HT 1080 和 NIH 3T3 細胞株可透過孔洞朝向化學引導劑移動，而 MCF-7 細胞則不能。只有 HT 1080 細胞系可以穿過 Matrigel^® 包覆的膜入侵。

除了水晶紫染色外，還用 DAPI 對細胞進行染色，以便使用螢光顯微鏡進行成像和計數（如圖 4 所示）。使用帶有 DAPI 濾光片的 10 倍物鏡完成成像。獲取影像後，可在每個插入物的四個視場中計算移動/入侵的細胞。DAPI 是一種核染色，可以更容易地計算遷移/移入的細胞，尤其是當有大量細胞出現在較高的播種密度時。

圖 4. DAPI 染色的移行細胞（A - HT1080，B - NIH 3T3，C - MCF-7）在 24 小時後，在不同的播種密度下，加入或不加入 10% FBS 和 Matrigel^® (200 µg/mL)。代表圖片來自每個播種密度下一個插入複製品的一個視野。HT 1080 和 NIH 3T3 細胞株可透過孔洞朝向化學引導劑移動，而 MCF-7 細胞則不能。只有 HT 1080 細胞系可以穿過 Matrigel^® 包覆的膜入侵。

本實驗的目的是在孵育 24 小時後，使用 10% FBS 作為三種不同細胞株的化學吸引劑，優化遷移和侵襲試驗的播種密度。在 DAPI 染色和成像後，透過平均四個視場的細胞數，計算出每個插片中移動或入侵的細胞數。結果的圖表顯示於圖 5。這些結果讓我們確定本實驗中的最佳播種密度為每個插入物有 25,000 個細胞進行遷移和入侵測試。含有化學引導劑（+FBS）的插入物和陰性對照（-FBS）之間的細胞數有很好的分離，每插入物25,000個細胞的播種密度對於兩個遷移細胞株顯示出最佳信噪比（HT 1080和NIH 3T3分別為5:1和6:1）。適當的播種密度取決於使用者要測試的特定條件（例如，遷移時間、使用的細胞株、使用的化學吸引劑等） 

圖 5. 24小時後，在不同的播種密度下，加入或不加入10% FBS和Matrigel^® (200 µg/mL)，膜基側遷移細胞的定量（顯示從三個插入複製的四個視野計算的平均細胞數量）。HT 1080 和 NIH 3T3 細胞系可以穿過小孔朝向化學引導劑移動，而 MCF-7 細胞則不能。只有 HT 1080 細胞系可以穿過 Matrigel^® 包覆的膜入侵。

遷移和侵襲試驗的技巧和竅門

• 重要的是，要將細胞培養插入不含化學引導劑的培養基，作為陰性對照，以及確定背景遷移。
• 製備細胞懸液時，要小心打散成團的細胞（用較小口徑的移液器手動輕輕移動），避免細胞聚集在插入物的中間或邊緣。務必使用加溫的培養基，以確保細胞不會聚集。
• 確保將細胞培養插片正確放置在組織培養板的孔中。有幾種不同類型的板可以使用懸掛式插入物，因此插入物的正確就位非常重要，這樣才能讓細胞平均移動/侵入。
  
• 確保板蓋能正確關閉，以防止培養期間的蒸發（如果細胞培養插片移位，您可以在轉移後使用鉗子，用戴著手套的乾淨手將細胞培養插片移到適當位置）。
  
• 確保將細胞懸浮在無血清培養基，並在將它們接種到孔中之前輕輕地移動幾次，以避免任何污染，並減少細胞結塊。
• 根據實驗和選擇的細胞類型，優化不同的參數，如侵染時間、接種密度和 Matrigel^® 濃度，以獲得更好的準確性和結果，這點很關鍵。
• 將 Matrigel^® 移液到每個插入物時，盡可能避免氣泡。
• 在接種細胞前，確保 Matrigel^® 包覆層均勻分佈和凝固。
• 從膜頂端移除非遷移性/侵入性細胞時要非常小心。
• 用镊子夹起细胞培养插片，然后将插片转移到戴有清洁手套的手上，以便在拭擦插片时帮助抓握。
• 可以使用不同的固定劑，如 70% 乙醇或 7% 多聚甲醛。當使用酒精固定細胞並結合水晶紫染色時，請確保在幾天之內對細胞進行成像和計數，因為如果放置時間過長，細胞結構可能會變得模糊，而且更難計數。
• 染色後，Millicell^®插入物應妥善保存，以避免乾燥和成像模糊。

圖 6. Millicell^®插入物的水晶紫染色。 A.移除Millicell^®插入物時對其施加的壓力過大，導致膜壓痕，成像時插入物不在同一焦平面上。B.使用乙醇作為固定劑對Millicell^®插入物進行水晶紫染色。使用乙醇作為固定劑時，樣品應儘快成像，以避免乙醇使細胞形態變形。

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