使用 Millicell^® 超低附著板評估球面形成與穩定性

• Scaffold-Free 3D Cell Culture Methods
• Millicell^® Ultra-low Attachment Plates
• Spheroid Formation and Robustness Analysis Protocol
• Spheroid Formation Results
• 球面圓度分析
• Scaffold-Free 3D Cell Culture Methods 

  三維細胞培養是一種重要的體外替代傳統二維細胞培養的方法。在某些細胞研究應用中，例如癌症研究、再生醫學、實驗藥物發現等，3D 模型可以更貼切地複製體內結構。常見的 3D 實驗模型可分為兩種不同的方法 - 基於支架的方法和不含支架的方法。

  在無支架方法中，細胞並不是生長在任何物理支架上，例如或結構支架。由於缺乏支架，細胞系形成稱為球體的 3D 細胞聚集體。此方法可讓細胞直接與基底、其他細胞及細胞外基質 (ECM) 進行全方位互動。研究人員通常使用球體來篩選高通量藥物開發和毒理研究中的化合物。

  Millicell^®超低附著力平板

  。

  Millicell^® Ultra-low Attachment (ULA) Plates 鍍有獨特的超親水聚合物。這種平板可在無支架、高通量的環境中促進均勻球體的自我組裝。

  Millicell^®ULA板也具有高光學清晰度，因此適用於明視場成像和共焦顯微鏡。

  在此，我們展示了如何使用 Millicell^® ULA板來計算球形物形成試驗過程中球形物的圓度和圓整度。

圖 1. Millicell^® 超低附著力平板。該板具有磨砂表面，可提高讀板速度並消除光線眩光，板的頂部和底部具有編號，可在 96 孔中輕鬆導覽。

Spheroid Formation and Robustness Analysis Protocol 

1.將細胞株A549、HeLa和MCF7 加入透明 Millicell^® ULA U-bottomed 96 孔板中，每孔 5,000 個細胞。

2.讓細胞生長和分裂 24-72 小時。

3.在 24 小時、3 天、5 天和 7 天的時間點進行明視場和相位成像，以確認單球形成。

4.確定和量化每個球體的面積、圓度和圓度。在 ImageJ 中根據球體內的像素/µm²計算球體面積.

5.使用共焦成像在 Millicell^® ULA U-bottomed 96 孔板中以 10X 和 20X 放大倍率評估 7 天時的球體形成。

圖 2. 使用明視場和共焦顯微鏡對球體進行成像，以展示 Millicell^® ULA 板的光學清晰度。

Spheroid Formation Results 

在 Millicell^® ULA和對照板中，球體成功形成，生長速度相似。A549細胞系形成的球體鬆散，需要幾天時間收縮緊實，才能形成完整的球體。HeLa和MCF7細胞株的生長較為線性，在平板播種後24小時內形成球形。Millicell^® ULA和對照板中的球形細胞形成沒有顯著差異，通過配對非參數數據的Wilcoxon T檢驗（P>0.05）。

圖 3. 與對照板相比，Millicell^® ULA 板中球形細胞的形成。A) A549 細胞；B) HeLa 細胞；C) MCF7 細胞。各細胞系的球形細胞形成無顯著差異。

球面圓度分析與結果 

球面圓度是文獻中常用來量化與分析球面形狀與形成的方法。球晶圓度通常用來表示球晶形成的緊密程度，並監測井內球晶周圍 ECM 的形成。

我們的圓度量化方法使用 ImageJ 中指定的感興趣區域來量化球面的圓度，以用於進一步的分析。下圖所示的計算將球面面積與根據球面最長直徑計算出的最大面積進行比較。使用此計算方法，完美圓球的圓度會達到或接近 1。對於所有細胞類型，Millicell^® ULA與對照板之間的球面圓度沒有顯著差異（圖 4）。

圖 4. 光場影像顯示形成球形的細胞系的球形圓度。A) A549 細胞系球形細胞；B) HeLa 細胞系球形細胞；C) MCF7 細胞系球形細胞；D)Millicell^® ULA 與對照板之間的球形圓度量化。

球面循環性分析 

評估球面形成的另一種常用方法是監測球面循環性。球面圓度是用來分析球面是否平滑。

較粗糙或凹凸不平的球體（如 MCF7 細胞株）會有較低的圓度值，因為球體的周長比較平滑的球體（如 HeLa 細胞株）的周長長。使用下圖所示的計算，使用 Millicell^® ULA板形成的球體與在對照板中形成的球體具有相等的圓度。在 Millicell^® ULA中形成的球體的圓度值在0.6到0.8之間（圖5）。

圖 5. 明視野影像顯示球形形成細胞系的球形圓度。A) A549 細胞系球形細胞；B) HeLa 細胞系球形細胞；C) MCF7 細胞系球形細胞；D)Millicell^® ULA 與對照板之間的球形圓度量化。

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