使用 TrueGel3D^® HTS 水凝胶板進行高通量三維細胞培養

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• TrueGel3D^® 用於 3D 細胞培養的 HTS 水凝胶產品

三維細胞培養模型已經成為動物模型的替代品，並創造了更具預測性的體外細胞模型，用於藥物發現和化合物篩選。傳統的 3D 細胞培養依靠將細胞包裹在未定義的 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 肉瘤衍生基底膜 (BME) 提取物中，例如 Matrigel^® 基質 (E1270)。這些水凝膠含有生長因子 (TGFβ、EGF、IGF 等) 和 ECM 蛋白 (層粘蛋白、膠原蛋白、entactin 等) 的異質混合物，濃度較高，非生理濃度。由於材料對溫度極度敏感，這些水凝膠需要費力的樣品製備步驟和預防措施，因此不適合高通量藥物篩選應用。最近，針對 3D 培養開發了更明確的合成水凝膠，這些水凝膠更穩定且不含動物，但仍需要使用者將細胞和水凝膠預先混合在一起進行包覆。

TrueGel3D® HTS 水凝胶板是一种即用型解决方案，可使用全合成水凝胶以简单、自动化兼容的方式轻松建立三维细胞培养。96 孔聚苯乙烯玻璃底板含有預鑄的合成功能化 PEG 基水凝膠。這些創新的水凝膠在整個孔內含有逐漸增加的交聯密度。使用者可直接進行細胞播種，無需任何水凝膠製備或包覆步驟。細胞播種後，細胞會逐漸滲透水凝膠，並在數天內建立 3D 細胞培養環境。此外，這種全新設計的水凝膠表面讓使用者可以在同一個水凝膠孔中，以不同的時間點接種不同的細胞群，依序建立共培殖系統。

特色與優點：

• 無需水凝膠組裝步驟：
• 完全合成：批次與批次之間的一致性以及對培養條件的控制。不含動物衍生產品。
• 順序接種：可輕鬆地在不同時間點共同培養各種細胞群：玻璃底 96 孔黑色聚苯乙烯板。預製的水凝膠在光學上是透明的。

圖 1. TrueGel3D^® HTS 水凝膠板技術概述。合成官能化 PEG 水凝膠預先預製在玻璃底黑色聚苯乙烯 96 孔成像板中¹

3D Cell Culture Protocols

Differentiation of Human Neural Stem Cells using TrueGel3D^® HTS Hydrogel Plates
使用 TrueGel3D^® HTS 水凝胶板擴展和分化人間充質幹細胞

TrueGel3D^® HTS 水凝胶板视频

Slide 1 of 3

Tumor Spheroid/Fibroblasts

Watch how to recreate tumor microenvironments in 3-dimensions.

T-cell Tumor Cell Killing

Watch the process of T-cell mediated tumor cell killing in 3-dimensions.

Mesenchymal Stem Cells

Watch the growth of human MSCs in 3-dimensions.

水凝膠化學

此合成水凝膠是由酵素交聯的多臂聚乙二醇 (PEG) - 多肽生物接合物所組成。多臂 PEG 單體與包含金屬蛋白酶可清除動機的縮氨酸進行終端結合，以支援細胞介導的降解、細胞黏附動機和酵素交聯位點。聚合網路是利用酵素轉膠凝反應聚合而成。在水凝膠澆注過程中，會形成獨特的專利水凝膠表面，由「深入」的交聯密度梯度組成。

如何使用 TrueGel3D^® HTS 水凝胶板

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步驟 1： 移除儲存緩衝區。

步驟 2： 加入細胞和培養基，培養過夜。

步驟 3： 建立共培養（選擇性）：加入輔助細胞並培養過夜。註：更詳細的步驟說明請參閱線上的 TrueGel3D^® HTS Hydrogel Plate 使用指南。

水凝胶在免疫腫瘤學中的應用

圖 2.T 细胞介导的肿瘤细胞杀伤。 A) 在 TrueGel3D^® HTS 水凝膠中，EBC-1 人類肺鱗癌細胞與活化 (+Cpd)/ 非活化 CD3+/CD23+ T 細胞 (紅色) 一起培養。培養 72 小時後，使用綠色核酸活/死細胞染料分析細胞毒性。EBC-1細胞與Cpd活化T細胞的共培養顯示出增強的（2倍）劑量依賴性腫瘤細胞殺死超時間。

水凝胶在腫瘤球形成中的應用

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圖 3.腫瘤球體形成。 將10,000個MIA-PaCa-2人類胰腺癌細胞接種到TrueGel3D^® HTS 水凝胶中接种并培养 14 天，培养液为 DMEM、10% FBS、1% Pen/Strep。14 天後對細胞角蛋白 19 (CK19) (紅色) 進行染色。14 天後細胞顯示強大的腫瘤球體形成。可培養各種癌細胞系和原代腫瘤細胞，觀察腫瘤球形體的形成和腫瘤細胞對周圍基質的侵襲。

水凝胶在血管生成中的應用

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圖 4.血管生成實驗。 在 200 µL 生長培養基（70%MEM-α, 20% EGM-2, 10% FBS, 1% Pen/Strep and 10 ng/mL FGF).FGF、VEGF或Netrin-4於翌日加入培養基，以評估它們的血管生成潛力。在第 10 天透過成像和量化內皮細胞小管的長度來分析血管生成。FGF 和 VEGF 增加了血管生成，而 Netrin-4 抑制了血管生成。

圖 5.間充質幹細胞/內皮細胞共培養。 人類間充質干細胞（紅色）和 HUVECs（綠色）在傳統水凝膠（左）或 TrueGel3D^® HTS 水凝膠（右/底）中共培養 7 天。傳統水凝膠上的細胞停留在表面且分離，而沉積在 TrueGel3D^® HTS 水凝膠中的細胞則侵入凝膠並自組織成繩索狀血管化 3D 結構。

水凝胶和腫瘤微環境

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圖 6.腫瘤細胞微環境。 將 10,000 個 RFP 標籤成纖維母細胞接種在 TrueGel3D^® HTS 水凝膠中，200 µL 入侵培養基（Pen/Strep 中。>MEM-α, 10% FBS, 1% Pen/Strep and 10 ng/mL PDGF).經過 5 天的預培養後，接種 7,000 個胰腺癌細胞 (MIA-Paca-2)以建立共培養物，並維持長達 2 週。水凝胶表面俯视图 (A) 和凝胶内部特写 (B)。明視場顯微鏡顯示 MIA-Paca 細胞在癌細胞培養第一週期間，與預先接種的纖維母細胞共同生長與入侵 (C-E)。

圖 7.細胞外基質沉積。 將 10,000 個 RFP 標籤成纖維母細胞接種在 TrueGel3D^® HTS Hydrogel 中 200 µL 的侵襲培養基（Pen/Strep 中。>MEM-alpha、10% FBS、1% PDGF）中。翌日，將操縱 ECM 的化合物加入培養基。(A, B) 成纖維細胞 (紅色) 與內源性纖維連蛋白 (綠色) 的共焦顯微圖。(C、D) 成纖維細胞培養 14 天後膠原沉積的共焦顯微圖，無 (C) 或有 (D) 50 g/L 抗壞血酸。

水凝胶在幹細胞培養中的應用

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圖 8.人間充質幹細胞 3D 培養。 在TrueGel3D^® HTS水凝膠中培養的人體脂肪衍生間充質干細胞會浸潤水凝膠，並在培養7天後顯示出3D表型。相反地，接種在傳統製備的水凝膠 (Matrigel^® 基質) 上的 hMSCs 會在水凝膠表面單層生長，並且不會顯示 3D 表型。

圖 9.3T3-L1 脂肪細胞分化。 脂肪生成分化培養基（中/右）在 TrueGel3D^® HTS 水凝胶中培養 21 天。分化 21 天後出現含脂質空泡的 3D 葡萄狀結構（動脈蛋白（紅色）、脂質（綠色）和核（藍色）。

水凝胶在神經科學中的應用

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圖 10.神經元-心絲細胞共培養。 iPS細胞衍生的神經元（灰色）和星形細胞（GFAP，紅色）在TrueGel3D^® HTS水凝膠中共同培養15天。依序加入星形細胞可提高細胞存活率及增強神經活動（鈣信號，資料未顯示），顯示細胞成熟度增加。

圖 11.神經幹細胞分化。 25,000 iPSC衍生神經幹細胞在TrueGel3D^® HTS水凝膠中培養，並讓其分化7-15天。分化後的細胞顯示出神經表型，TUJ-1 表達增加（綠色），並顯示出複雜的神經網路。鈣成像（GCaMP6）也在第 17 天進行（數據未顯示），顯示活躍的功能性鈣尖峰。之後，也可以加入膠質細胞來支援培養物的成熟，並研究它們與神經元的互動。

水凝胶在 ADME/毒理學中的應用

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圖 12.肝細胞/肝星形細胞共培養。 在TrueGel3D^® HTS水凝膠中培養的HUH-7肝癌細胞傾向於在整個水凝膠中形成球形聚集體。然而，在TrueGel3D^® HTS水凝膠中預先接種肝臟星狀細胞培養5天的HUH-7細胞，傾向於在星狀細胞上形成類似肝臟組織的單層。

參考資料

1. Zhang N, Milleret V, Thompson-Steckel G, Huang N, Vörös J, Simona BR, Ehrbar M. 2017. Soft Hydrogels Featuring In-Depth Surface Density Gradients for the Simple Establishment of 3D Tissue Models for Screening Applications. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 22(5):635-644. https://doi.org/10.1177/2472555217693191