文档记录
源自操作步骤SSPHYT02。包括模板根据现行SOP规范更新和整合注意事项到操作步骤。参阅SOP-DEK-ENZ18。
1.目标
该程序的目的在于测定植酸酶（货号P9792）的活性。
2.适用范围
本操作步骤的适用范围包括以下反应：
植酸 + H2O 植酸酶 > p-myo-inositol 1,2,4,5,6-PKP + Pi
3.定义
3.1. 纯水 - 来自去离子系统的水，电阻率>或= 18MΩcm @ 25 °C。
3.2. p-myo-inositol 1,2,4,5,6-PKP = p-肌-肌醇 1,2,4,5,6- 五磷酸
3.3. 植酸 = 肌-肌醇六（二氢磷酸）
3.4. Pi = 无机磷酸盐
3.5. 植酸酶的单位定义 = 在pH 2.5、37 °C下，一个单位每分钟将从4.2 X 10-2 M植酸中释放1.0 μmol无机磷酸。
4.讨论
4.1. 植酸 + H2O 植酸酶 > p-myo-inositol 1,2,4,5,6-PKP + Pi
4.2. 方法 = 比色测定，温度 (T) = 37°C，pH = 2.5，A400nm，光程 = 1cm
5.责任
我们所有工作人员都有责任遵循本书面操作规程。
6.安全
测定开始之前，请参阅每种化学品的MSDS。
7.操作流程
7.1 试剂
7.1.1 200 mM甘氨酸缓冲液，pH 2.8、37 °C（缓冲液）
7.1.1.1. 配制100 mL，用纯水溶解甘氨酸，盐酸，货号 G7126。
7.1.1.2. 用1 M NaOH或1 M HCl将pH在37 °C下调至2.5。
7.1.2. 44.1 mM植酸溶液，pH 2.5、37 °C(植酸)
7.1.2.1. 配制 10 mL，试剂7.1.1溶解植酸，二钾盐，货号 P5681。
7.1.2.2. 用1M HCl将pH在37 °C下调至2.5。
7.1.3. 5% (w/v) 钼酸铵溶液（Amm Moly）
配制100 mL，纯水溶解钼酸，四水铵盐，货号 M0878。
7.1.4 5N 硫酸溶液
配制 100 mL，纯水溶解硫酸，95-98%，A.C.S.试剂，货号258105。
7.1.5 丙酮
使用丙酮，A.C.S.试剂级，货号 179124。
7.1.6 显色剂 (CRS)
7.1.6.1 配制100 mL，25 ml试剂7.1.3加入到25 mL试剂7.1.4和50 mL试剂7.1.5。
7.1.6.2 混匀并立即使用。
7.1.6.3 新鲜配制。
7.1.7 50 mM磷酸钾溶液 (P Std.)
配制10 mL，用去离子水溶解磷酸钾，一元，无水，货号P5379。
7.1.8 植酸酶溶液(酶)
现用现配，用低温试剂7.1.1配制包含0.5-2.0单位/mL植酸酶的溶液。
7.2. 步骤——空白/试样制备
7.2.1. 将下列试剂移液转入（按ml）一个4 dram小瓶(vial)：
7.2.2. 平衡到37 °C，然后添加：
7.2.3. 立即倒置混匀并在37 °C下孵育整整30min。然后添加：
7.2.4. 涡旋混匀，然后将溶液转移到适宜的容器中，使用适宜的分光光度计记录试样和空白样的A400nm。
7.3. 步骤-标准曲线：
7.3.1 将下列试剂移液转入（按ml）适宜的容器中：
7.3.2 涡旋混匀并在37 °C下孵育30分钟。然后添加：
7.3.3 涡旋混匀，然后将溶液转移到合适的比色皿中，使用适宜的分光光度计记录标准样和标准空白样的A400nm。
7.4. 计算
7.4.1 标准曲线
7.4.1.1 ΔA400nm标准样 = A400nm标准样 - A400nm标准空白样
7.4.1.2 绘制ΔA400nm相对磷酸μmol量的标准曲线。
7.4.2 样品测定
7.4.2.1 ΔA400nm试样 = A400nm试样 - A400nm空白试样
7.4.2.2 使用标准曲线测定释放磷酸的μmol量。
| 7.5.2.3 | 单位/ml酶 = | （释放磷酸的µmol量）(df) |
| (30)(0.025) |
式中：
df = 稀释因子
30 = 每定义单位的检测时间（分钟）
0.025 = 所用酶的容积(ml)
| 7.4.2.4 | 单位/mg固体 = | 单位/ml酶 |
| Mg固体/mL酶 |
8.参考文献和附件
9审批
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