神经氨酸酶酶促检测方法

1.目标

建立神经氨酸酶酶促测定的标准化操作流程。

2.适用范围

 本操作流程适用于所有酶促测定神经氨酸酶成分活性参数的产品。

不可用于测定来自新城疫病毒的神经氨酸酶（货号N5146），或来自化脓性链球菌的神经氨酸酶（货号N5271）。

3.定义

单位定义 – 在pH 5.0、37 ^oC条件下，一单位可以N-乙酰神经胺乳糖为底物每分钟释放出1.0 μmole乙酰神经氨酸。

纯水 – 来自去离子系统的水，电阻率>或=18MΩ•cm @25 ºC

NANA – N-乙酰神经氨酸

4.讨论

N-乙酰神经胺乳糖 + H₂O ^{神经氨酸酶}> NANA + 乳糖

5.责任

分析服务人员应遵循本书面实验方案。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项，参阅安全数据说明书（SDS）。

7.操作流程

7.1条件：

 37ºC，pH=5.0，A_550nm，光程=1 cm

7.2 方法：比色法

7.3.试剂

7.3.1 含有2 mM氯化钙的100 mM乙酸钠缓冲液，在37^oC条件下的pH值为5.0（缓冲液）

7.3.1.1 采用纯水和无水醋酸钠（货号S8750）和氯化钙二水合物（货号C3881）配制100 mL溶液。

7.3.1.2 在37^oC下，使用1 M HCl调整pH至5.0。

7.3.1.3 仅来自霍乱弧菌的神经氨酸酶需要钙离子；但存在的钙离子并不会干扰其他来源神经氨酸酶的活性。

7.3.2 0.085% (w/v) N-乙酰神经胺乳糖（2→3）异构体溶液（NAN-乳糖）利用试剂7.3.1和N-乙酰神经胺乳糖（货号A3307）配制0.85 mg/ml的溶液。

7.3.2.2 此检测体系在低于底物Km值的情况下运行。2→3 isomer浓度保持0.085% (w/v)非常重要。请根据实际情况校正水和异构体含量。

7.3.3 0.2% (w/v)牛血清白蛋白溶液(BSA)
采用纯水和牛白蛋白（货号A6003）配制2 mg/ml的溶液。

7.3.4 5% (w/v) 磷钨酸溶液 (PT)
采用2.5 M HCl和游离酸磷钨酸（货号 P4006）配制50 mg/mL的溶液。

7.3.5 神经氨酸酶溶液（酶）
临使用前，利用低温试剂7.3.3配制约含0.03–0.09 unit/ml神经氨酸酶的溶液。

7.3.6 9 M磷酸溶液(PAS)
利用纯水和磷酸（货号215104）配制20 mL的溶液。

7.3.7 200 mM过碘酸钠溶液 (Per)
利用试剂7.3.6和过磷酸钠（货号S1878）配制10 mL溶液。

7.3.8 含50 mM硫酸和500 mM硫酸钠溶液的10% (w/v) 亚砷酸钠溶液 (Ars)
利用纯水、亚砷酸钠（货号S7400）、硫酸（货号258105）和无水硫酸钠（货号S9627）配制50 mL溶液。

7.3.9 含500mM 硫酸钠溶液的0.6% (w/v) 硫代巴比妥酸(TBA)
利用纯水、2-硫代巴比妥酸（货号T5500）和无水硫酸钠（货号S9627）配制200 mL溶液。

7.3.10 5% (v/v) HCl丁醇溶液(But)
混合5 mL浓缩HCl（货号258148）和95 mL n-丁醇（货号B0878），配制成溶液。

7.3.11 0.20 mM N-乙酰神经氨酸标准溶液(NANA)
利用纯水和N-乙酰神经氨酸（货号A2388）配制100 mL溶液。

7.4 酶孵育检测法

7.4.1 将下列试剂移液（毫升级）至合适的容器中：

		试样
	试样	空白样
试剂7.3.1（缓冲液）	0.20	0.20
试剂7.3.2（NAN-乳糖）	0.20	0.20

7.4.2   倒置混匀，平衡至 37^oC。然后添加：

试剂7.3.5（酶）	0.10	------
试剂 7.3.3（BSA）	------	0.10

7.4.3 倒置混匀并37^oC孵育10分钟整。然后添加：

试剂7.3.4（PT）

0.50

0.50

7.4.4 即刻倒转、低速离心3分钟混匀。

7.5 标准曲线

7.5.1 将下述试剂(ml)加样到适宜的容器中：

							Std
	标准样 1	标准样 2	标准样 3	标准样 4	Std 5	Std 6	空白样
试剂 7.3.11（NANA）	0.05	0.10	0.20	0.30	0.40	0.50	-----
纯水	0.45	0.40	0.30	0.20	0.10	-----	0.50
试剂7.3.4（PT）	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50

7.5.2 即刻倒转、低速离心3分钟混匀。

7.6 显色反应

7.6.1 将下述试剂(ml)加样到适宜的容器中：

		试样							Std
	试样	空白样	标准样 1	标准样 2	标准样 3	标准样 4	Std 5	Std 6	空白样
试样上清液	0.50	------	------	------	------	------	------	------	------
空白试样上清液	------	0.50	------	------	------	------	------	------	------
Std 1上清液	------	------	0.50	------	------	------	------	------	------
Std 2上清液	------	------	------	0.50	------	------	------	------	------
Std 3上清液	------	------	------	------	0.50	------	------	------	------
Std 4上清液	------	------	------	------	------	0.50	------	------	------
Std 5上清液	------	------	------	------	------	------	0.50	------	------
Std 6上清液	------	------	------	------	------	------	------	0.50	------
标准空白样上清液	------	------	------	------	------	------	------	------	0.50
试剂7.3.7 (Per)	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10

7.6.2 倒置混匀并25 °C 孵育20分钟。然后加入：

试剂7.3.8（Ars）

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

7.6.3 涡旋直至黄棕色显色消失，然后添加：

试剂 7.3.9（TBA）

3.00

3.00

3.00

3.00

3.00

3.00

3.00

3.00

3.00

7.6.4 转移到沸水浴中孵育15分钟，冷却至室温，然后添加：

试剂7.3.10（But）

4.60

4.60

4.60

4.60

4.60

4.60

4.60

4.60

4.60

7.6.5 振荡或涡旋溶液，直至大多数粉色成分从下层提取出来。

7.6.6 ~1000 rpm低速离心2-3分钟。

7.6.7 将上层溶液转移至适当的比色皿中，然后立即记录试样、空白试样、标准品和标准空白样的A_550nm。

7.7计算

7.7.1标准曲线：

 7.7.1.1 ΔA550nm 标准品 =A_550nm 标准品 – A_550nm  标准空白样

7.7.1.2 绘制标准品的ΔA_550nm和N-乙酰神经氨酸微摩尔量的关系图。计算并记录斜率、y轴截距和线性回归（r2）。

7.7.2样品测定：  使用标准曲线确定释放的N-乙酰神经氨酸微摩尔量。

	单位/mL 酶 =	(释放的NANA得μmol数)(df)
		(0.10)(10)

df = 稀释系数
0.10 = 所用的酶体积(mL)
10 = 每单位反应体系的反应时间(min)

7.8 检测体系终浓度
在0.50 mL反应混合物中，终浓度为80 mM醋酸钠、1.6 mM氯化钙、0.034% (w/v) N-乙酰神经胺乳糖(2→3 isomer)、0.04% (w/v)牛血清白蛋白以及0.003 – 0.009单位神经氨酸酶。

参考文献

1.Schneir, M.L. and Rafelson, M.E., Jr. (1996) Biochim.Biophys.Acta.130, 1-11.

2.Cassidy, J.T., Jourdia, G.W., and Roseman, S. (1965) J. Biol. Chem. 240, 3501-3506.

3.Warren, L. (1959) J Biol. Chem. 234, 1971-1975.