酸性磷酸酶的酶促测定（EC 3.1.3.2）

1.目标

建立酸性磷酸酶酶促测定的标准化操作流程。

2.适用范围

此实验步骤适用于所有测定酸性磷酸酶参数的产品。

3.定义

3.1纯净水 - 来自去离子系统的水，电阻率>或=18MΩ•cm @25 ºC

3.2.活力单位定义 - 一个单位可在pH 4.8，37ºC下每分钟水解1.0μmole的对硝基苯磷酸盐。

4.讨论

对硝基苯磷酸盐 + H₂O ^{酸性磷酸酶}>对硝基苯酚 + P_i

5.责任

分析服务人员应遵循本书面实验方案。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项，参阅安全数据说明书（SDS）。

7.操作流程

7.1 条件：
T = 37℃，pH = 4.8，A_410nm，光路= 1 cm

7.2 方法：
光谱法终止测定

7.3 试剂：

7.3.1 90 mM柠檬酸盐缓冲液，37 °C下pH为4.8（缓冲液）
利用纯水和柠檬酸三钠二水合物（货号C7254），配制26.5 mg/mL的溶液。在37 °C下用1 M NaOH/HCL调节至pH 4.8。

7.3.2 15.2 mM 对硝基苯磷酸盐(PNPP)
在纯水中加入硝基苯基磷酸盐配制5.64mg/mL的溶液。

7.3.3 100 mM氢氧化钠溶液 (NaOH)
使用200 mL容量瓶，利用纯水稀释20 mL的1.0 N氢氧化钠（货号S2567），配制200 mL溶液。

7.3.4 酸性磷酸酶酶溶液（酶）
临使用前，利用低温纯水和酸性磷酸酶配制0.15-0.25单位/mL的溶液。

7.4 测定方法

7.4.1 将下列试剂移液（毫升级）至合适的容器中：

	试样	空白样
试剂7.3.1（缓冲液）	0.50	0.50
试剂7.3.2（PNPP）	0.50	0.50

7.4.2 倒置混匀，平衡至37 oC。然后添加：

试剂7.3.4（酶）

0.10

----

7.4.3 立即倒置混匀并37oC孵育10分钟整。然后添加：

试剂7.3.3（NaOH）	4.00	4.00
试剂7.3.4（酶）	-----	0.10

7.4.4 倒置混匀并使用合适的分光光度计记录试样和空白样在A410nm处的吸光度。

7.5 计算

7.5.1	单位/ml酶 =	Δa410nm410nm 试样 - ΔA410nm空白样)*(5.1)*(df)
		（10）*（18.3）*（0.1）

 

式中：
     5.1=溶液总体积(mL)
df = 稀释系数
10 = 每单位的检测体系(mL)的反应时间
18.3 = 对硝基苯酚的毫摩尔消光系数
0.1 = 所用的酶体积(mL)

7.5.2	单位/mg 固体 =	单位/mL 酶
		mg 固体/mL 酶

 

7.5.3	单位/mg 固体 =	单位/mL 酶
		mg 固体/mL 酶

 

7.6 反应体系浓度
在1.10 mL反应混合物中，终浓度为柠檬酸41mM、对硝基苯磷酸盐6.9mM、酸性磷酸酶0.015-0.025单位。

参考文献

1. Bergmeyer H, Gawehn K, Grassl M. 1974. Methods of Enzymatic Analysis. Volume I, 2nd ed.. New York, NY: Academic Press, Inc..