溶解酶的酵素分析

說明

本程序可用於以貝氏酵母為底物的溶菌酶活性測定。比浊速率测定[800 nm 处的吸光度（A₈₀₀），光程 = 1 cm]基于以下反应：

單位定義：以酵母懸浮液為底物，在 3 mL 反應混合物中，pH 7.5、25 °C 時，一個單位的溶菌酶每分鐘可產生 0.001 的 ΔA₈₀₀。

所需的試劑和設備

• 1M磷酸鉀單鹽溶液（目錄編號 P8709）
• 1 M 磷酸二氢钾溶液
• 來自 Saccharomyces cerevisiae的山雞乳 (Catalog Number YSC1)

注意事項 - 請參閱安全資料表，以瞭解有關危害和安全處理實務的資訊。

製備說明

使用超純水 (25°C時電阻率≥18 MΩxcm) 製備試劑。

磷酸緩衝液 (67 mM 磷酸鉀緩衝液，pH 7.5, at 25 °C) - 配制 100 mL：

1. 用移液管吸取 1.33 mL 1 M 磷酸鉀單基質溶液（目錄編號 P8709）到適當的燒杯中。37 mL 1 M 磷酸二氢钾溶液（目录编号 P8584）。
2. 用超纯水稀释至 100 mL。
3. 用 1 M KOH 调节 pH 至 7.5。

底物 [0.4%（w/v）的麵包酵母（來自Saccharomyces cerevisiae的酵母）懸浮液] -

1. 使用研杵研磨適量的酵母（目錄編號 YSC1）以獲得大於 800 mg 的粉末。

2. 使用粉末，在超純水中製備 4 mg/mL 的酵母懸浮液。

3. 以產生最小漩渦的速度攪拌溶液。在室溫下攪拌約 1 小時。
   注意：以較高的速度攪拌可能會導致酵母細胞過早溶解。小心地將上清液的三分之二倒入新的燒杯中。移除較大的沉澱物將使進行檢測時分光光度計讀數的雜訊量減至最低。將下列試劑移入適當的比色管中：

Substrate (mL)
Ultrapure Water	1.50	0.60
1.50	1.50
Substrate, step 4	-	0.90

   b.測量酵母混合物相對於超純水的 A₈₀₀。ΔA₈₀₀ [ΔA_{800(Substrate)} = A_{800(Substrate)} - A_800(Blank)] 必須介於 0.7 -1.0 之間。如有必要，可使用適量的酵母粉或超純水調整吸光度。

6. 在整個檢測過程中，在室溫下緩慢混和底物（盡量少攪拌）。

酵素溶液 - 製備 10 mg 固體/ml 溶液。 使用前，立即製備二次稀釋，使修正的 ΔA₈₀₀/min 落在 0.025 和 0.035 之間。

注意事項：

• 對於某些粗製的裂解酶產品，可能需要 15 分鐘以上才能進入溶液。1-15秒的短時間聲波處理可以幫助溶解酵素而不影響酵素活性。

• 如果校正吸光度小於 0.025，使酶更濃，以達到0.025-0.035之間的校正吸光度.

• 如果校正吸光度超過0.035使酶降低濃度以達到校正吸光度在0.025-0.035之間。

過程

在3.00 mL反应混合物中，最终浓度为34 mM磷酸二氢钾、~0.12%（w/v）面包酵母和25-35个单位的Lyticase。

1. 用移液管将下列试剂移入合适的容器中：

試劑	測試 1 (mL)	測試 2 (mL)	Blank (mL)
Ultrapure Water	0.55	0.55	0.55	0.60
磷酸緩衝液	1.50	1.50	1.50	1.50
底物	0.90	0.90	0.90	0.90

2. 倒轉混合測試和空白試管，平衡至 25 °C。然後加入酵素溶液：

試劑	測試 1 (mL)	測試 2 (mL)	空白 (mL)
酵素液	0.050	0.050	0.050	-

3. 立即倒置混和空白樣與所有測試。依序進行，以捕捉底物的沉降效應。記錄 A₈₀₀ 處約 10 分鐘吸光度的下降

4. 使用 2 分鐘的時間，使用各測試的最大線性速率獲得 ΔA₈₀₀/min。每項測試的速率都需要使用相對應的空白測試時間來進行修正。如果速率超出此範圍，請對酶濃度進行適當調整，並重複測試。

結果

計算

1.

其中：
df = 酵素的稀釋係數
0.001 = 根據單位定義 800 奈米吸光度的變化
0.050 = 反應中使用的酵素溶液的體積 (mL)

2.