ELISA 協定

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• 磷酸化分析步驟
• 細胞分析步驟

Sandwich分析步驟

1. 使用前將所有試劑和樣品置於室溫（18 - 25 °C）。
2. 將每種標準品及樣品 100 µL 加入適當的孔中。蓋上孔蓋，在室溫下培養 2.5 小時，或在 4 °C 下溫和振動過夜。
3. 丟棄溶液，用 1X 洗液洗 4 次。使用多通道移液管或自動清洗器，向每個孔注入清洗緩衝液（300 µL）進行清洗。在每個步驟中完全移除液體對良好的性能至關重要。最後一次洗滌後，吸出或倒出剩餘的洗滌緩衝液。將板倒置並用乾淨紙巾吸乾。
4. 每孔加入 100 µL 1x 備妥的檢測抗體。蓋上孔蓋，室溫下輕輕搖動孵育 1 小時。
5. 丟棄溶液。重複步驟 3 的洗滌程序。
6. 每孔加入 100 µL 配製好的 Streptavidin 溶液。蓋上孔蓋，在室溫下輕輕搖動孵育 45 分鐘。
7. 丟棄溶液。
8. 每孔加入 100 µL TMB 一步式底物試劑（H 項）。蓋上孔蓋，於室溫下在黑暗中溫育 30 分鐘，輕輕搖動。
9. 每孔加入 50 µL 停止液（項目 I）。立即在 450 nm 處讀取吸光度。

磷酸化分析步骤

1. 使用前将所有试剂置于室温（18 - 25 °C）。建議所有樣品或陽性對照應至少一式兩份。
2. 每份樣品或陽性對照應加入 100 µL 到適當的孔中。用板架蓋住孔，室溫孵育 2.5 小時或 4 °C 振動過夜。
3. 丟棄溶液，用 1x Wash Solution 洗 4 次。使用多通道移液管或自動清洗器，向每個孔注入清洗緩衝液（300 µL）進行清洗。在每個步驟中完全移除液體對良好的性能至關重要。最後一次洗滌後，吸出剩餘的洗滌緩衝液。倒置平板，用乾淨紙巾吸乾。
4. 每孔加入 100 µL 製備好的 1X 生物素化抗磷酸酪氨酸抗體。在室溫下振動孵育 1 小時。
5. 丟棄溶液。
6. 每孔加入 100 µL 製備好的 1X HRP-Streptavidin 溶液（見試劑製備步驟 6）。室溫下振動孵育 45 分鐘。
7. 丟棄溶液。
8. 每孔加入 100 µL TMB 一步式底物試劑（H 項）。在室溫下於黑暗處震動培養 30 分鐘。
9. 每孔加入 50 µL 停止液（項目 I）。立即在 450 nm 下讀數。

EIA分析步驟

1. 在試劑製備步驟中，將試劑保持在冰上。
2. 每孔加入 100 μL 抗 「目標 」抗體。室溫下孵育 1.5 小時，輕輕搖動（1-2 次/秒）。您也可以在 4 °C 下孵育過夜。
3. 棄掉溶液，用 1x 洗滌緩衝液（每孔 200-300 μl）洗孔 4 次，可以用多通道移液管或自動洗板機進行洗滌。在每個步驟中完全清除液體對良好的檢測性能至關重要。最後一次洗滌後，吸出或傾倒洗滌緩衝液，除去剩餘的緩衝液。將板倒置，用乾淨紙巾吸乾。
4. 在適當的孔中分別加入 100 μL 標準品、陽性對照品和樣品。確保包括一個空白孔（僅用於分析稀釋液）。蓋上孔蓋，室溫溫育 2.5 小時，輕輕搖動（1-2 次/秒）或 4 ℃過夜。
5. 丟棄溶液，按照步驟 3 的指示清洗 4 次。
6. 每孔加入 100 μL 配製好的 HRP-Streptavidin 溶液。室溫下輕輕搖動孵育 45 分鐘。
7. 按照步驟 3 的指示，丟棄溶液並清洗 4 次。
8. 每孔加入 100 μL TMB 一步式底物試劑（H 項）。在室溫下於黑暗處培養 30 分鐘，輕輕搖動（1-2 次/秒）。
9. 每孔加入 50 μL 停止液（項目 I）。立即於 450 nm 處讀取吸光度。

細胞分析步驟

注意： 所有孵育和洗滌步驟都必須在溫和的搖晃或旋轉（~1-2 次/秒）下進行。

1. 設計您的實驗。
   選用：如果接種 HUVECs、HMEC-1 或其他鬆散附著的細胞，在未塗層 96 孔微孔板（ITEM A）上加入 100 μL poly-L-Lysine （推薦 Sigma-Aldrich Product No. P4832），然後按照製造商的指示操作。可使用預塗的 CellBIND^® 微孔板或其他經聚賴氨酸處理的組織培養板代替 ITEM A。
2. 將 100 μL 的 10,000 至 30,000 個細胞注入所提供的未包被 96 孔微孔板（ITEM A）的每個孔中，並在 37 °C 與 5% CO₂ 下培養過夜。
   注意：使用的最佳細胞數因細胞系和蛋白質磷酸化的相對量而異。可以使用更多或更少的細胞，但必須根據經驗決定。注意：在使用抑制劑或活化劑處理前，可先將細胞凍結 ~4-24 小時 (視細胞品系而定)。         
3. 根據製造商的說明應用各種處理劑、抑制劑（如 siRNA 或化學物質）或活化劑，並孵育所需的時間點。 
   注意：建議在處理細胞前，先將抑制劑或活化劑溶解到無血清的細胞培養液中 (除非製造商的說明書中另有說明)。)        
4. 將微孔板倒置，在水槽上輕輕敲打微孔板底部，棄掉細胞培養液。
5. 用移液管移取 200 μL 配製好的 1X 洗滌緩衝液 A（項目 B）到各孔中進行洗滌。丟棄洗滌緩衝液（與步驟 4 相同），再洗滌 2 次，每次使用新的洗滌緩衝液，共洗滌 3 次。最後一次洗滌後，將微孔板放在紙巾上輕輕擦拭，以去除任何多餘/剩餘的緩衝液。
   注意：為避免細胞流失，請勿直接移液到細胞上。相反，請將液體沿細胞培養孔壁輕輕分佈。丟棄任何溶液時，也要避免使用真空吸力或太用力拍打微孔板。
6. 每孔加入 100 μL 固定液（ITEM D），室溫孵育 20 分鐘。
   注意：固定液用於使細胞透化。
7. 重複清洗步驟 5。
8. 每孔加入200 μL配制好的1X淬灭缓冲液（ITEM E），室温下孵育20分钟：
   注意：使用淬火緩衝液是為了使背景反應最小化。
9. 每孔加入 200 μL 製備好的 1X 阻斷緩衝液（ITEM F），37 ℃ 培養 1 小時。
10. 用準備好的 1X 洗滌緩衝液 B（項目 C）洗 3 次。
    注意：
    注意：如有需要，微孔板可在清洗後於 -80 °C儲存數天。
11. 在每個相應的孔中加入 50 μL 製備好的 1X 一抗（ITEM G-1、G-2、G-3、H- 1、H-2 或 H-3），室溫孵育 2 小時。
12. 用 1X 洗滌緩衝液 B 洗滌 4 次。
13. 每孔加入 50 μL 製備好的 1X HRP 結合二抗（ITEM I-2），室溫孵育 1 小時。
14. 重複步驟 13。
15. 每孔加入 100 μL TMB 底物（ITEM J），室溫暗處孵育 30 分鐘。
16. 每孔加入 50 μL 停止液（ITEM K）。立即在 450 nm 下讀數。

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