ELISpot 分析：功能性細胞免疫學
免疫反應與 Elispot - 必要性是創新之母
精確調節效應器功能對於發揮強效而特異的免疫反應至關重要。T 淋巴細胞提供了這個過程的架構，精巧地協調人體對抗感染和癌症的防禦。這是透過抗原特異性效應細胞系的高度選擇性接觸和活化來完成的。根據刺激的強度和性質，可能會引發各種效應器功能，包括細胞溶解活動、分泌多種細胞因子和其他生物活性分子、增殖以及選擇性歸巢到感染部位。由於這些 T 淋巴細胞及其反應代表了臨床結果的真正關聯因素，因此免疫診斷的最終目標就是可靠地識別一小部分的反應者，確定其作用模式，並準確地量化反應程度。雖然沒有任何一種檢測方法可以同時測量所有相關參數，但 ELISpot 可以在單細胞層面以優異的靈敏度和解析度對效應器功能進行多維度的定量評估。
ELISpot 分析法開發於1983年，1,2 代表了板式酶聯免疫吸附分析法（ELISA）與膜式 Western 印迹技術的結合，允許在單細胞層面檢測分泌的分析物質。相較於標準的聚苯乙烯表面，膜的結合特性大幅改善。雖然有許多選擇，但目前大多數的 Elispots 都是在聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜板上進行。捕獲抗體 (Ab) 的結合受苯丙氨酸或亮氨酸等氨基酸與 PVDF 之間的疏水相互作用所支配；這種結合比硝酸纖維表面的靜電相互作用強得多。3,4 更強的結合互動轉換為膜表面更大的 Ab 密度，從而形成更清晰的斑點。4 由於 ELISpot 的讀數為 "斑點/孔"，PVDF 膜的白色為斑點檢測和分析提供了理想的背景。微孔板格式進一步提供了更高的產量，並適於自動化；更多樣本、更多刺激物或更多不同細胞因子可在相鄰的孔中同時進行檢測。
ELISpot最初是為了識別分泌抗原特異性抗體的B細胞1,2而設計的，現在已被用於許多任務，其中最突出的是抗原特異性細胞因子反應的定量（圖1）。在標準檢測中，細胞因子特異性抗體固定在膜底 96 孔板上。接下來，在有或沒有刺激劑的情況下，將細胞（通常是全部外周血單核細胞 (PBMC) 或純化的子集）播種。隨著時間的推移，活化的細胞開始分泌細胞因子，這些細胞因子會與表達細胞附近的擷取抗體結合。然後洗掉細胞，在一步法（酵素結合、細胞激素特異性抗體）或兩步法（生物素化抗體/鏈霉親和素-酵素）的抗體結合過程後，透過底物沉積完成斑點偵測。一旦形成信號，可透過手動方式或使用附有分析軟體的圖像點閱讀器來統計點數。
本文將重點介紹 ELISpot 分析法獨特的性能特徵、工作流程屬性和成本效益，綜合考慮這些特徵、屬性和效益，可以清楚地確定 ELISpot 分析法是闡明免疫反應複雜性的絕佳平台。此外，我們還會概述與此技術相關的最新進展，以及這些改進如何為研究界帶來更大的裨益，無論是專注於機理研究、診斷還是治療設計。最後，我們將詳細討論檢測方案，並強調標準最佳實務和故障排除指南。
用于 T 細胞功能分析的 Elispot 平台無與倫比的功能
任何特定免疫反應的複雜性都是由許多可能需要評估的參數所突顯出來的，這些參數可讓您清楚了解該過程的生理機制。雖然存在許多檢測方式，但最常用於研究體外 T 細胞效應器功能的檢測方式包括流式細胞計、ELISpot、ELISA、多重珠陣列和定量 PCR。
ELISpot 和基於流式細胞計法的細胞內細胞素染色 (ICS) 一樣，可直接確定抗原 (Ag) 特異性 T 細胞的頻率，這是免疫診斷的核心能力。以上清液為基礎的檢測，例如 ELISA 或多重串珠陣列，則無法達到這樣的解析能力，因為這些檢測是以特定樣品孔中所有細胞所產生的大量細胞因子為基礎。在急性 HIV 受試者中，對常見召回抗原（如 TT 或 PPD）產生 IFNγ 的細胞頻率與健康捐獻者相當；然而，光點大小卻大幅減少5。此結果顯示 HIV 特異性 T 細胞功能受損，而非細胞數量受損。同樣地，與 "e;較舊"e;記憶性 T 細胞相比，最近在體內活化的 T 細胞可能會顯示每細胞細胞激素產量增加6,7。區分長期記憶和最近活化的子集的能力對自體免疫疾病和慢性感染的 T 細胞診斷有影響。大量檢測的結果也會受到先天性免疫系統背景信號的影響。Ag特異性反應的稀釋會導致整體信號扁平化；這個問題與檢測罕見群體的存在最有關，例如 PBMC 中的循環腫瘤細胞 (CTC) 或骨髓中的播散腫瘤細胞，這兩種細胞都是轉移的早期標記8.
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圖 1.ELISpot 分析工作流程。(1) 以捕獲抗體塗佈膜。加入免疫細胞並激發。(2) 有反應的細胞會產生細胞激素。細胞因子與細胞下方的擷取抗體結合。(3) 洗滌以除去細胞。加入第二個細胞激素特異性生物素化抗體，與細胞激素-抗體複合物結合。(4) 加入鏈霉親和素-酶結合物。(5) 加入酵素底物並顯影。在一個孔內，每個反應細胞會形成一個斑點。
為了使 T 細胞庫能夠識別潛在的無限數量的感染性物質，同時將它們與自身區分開來，總的幼稚細胞庫包含≥ 1012 獨特的 T 細胞受體 (TCR) 特異性。因此，在沒有感染的情況下，對任何一種抗原具有特異性的循環記憶細胞的頻率相當低，通常在 1:10,000 - 1,000,0009,10 的範圍內。此類罕見事件的檢測對流式平台而言是一大挑戰，據報靈敏度下限為 0.02%11。相對於 ELISpots，培養上清液中細胞因子測量的靈敏度下限會因為分析物在周圍環境中的稀釋、旁觀細胞的吸收和酵素降解而進一步降低。相比之下，ELISpot 分析法的檢測臨界值為每百萬個 PBMC 中少於 25 個產生 IFNγ 的 T 細胞 (0.0025%)12,13；這相當於檢測靈敏度提高了近 10 倍。ELISpot 檢測的高靈敏度對於過敏症研究也很重要，因為在過敏症研究中，鑑定極低頻率的Th2細胞製造細胞對於疾病監測和免疫療法的開發都很關鍵14。
ELISpot 是允許對生物功能（如細胞激素釋放）進行單細胞定量分析的少數技術之一。在細胞內細胞激素染色（ICS）中，細胞激素的檢測發生在釋放之前，在分泌過程之前或過程中，由於轉譯後的調節，有可能產生誤導性的結果16。ICS 分析的持續時間會受到蛋白質傳輸抑制劑（如 Brefeldin A 或 Momensin）毒性的限制。對於定量 RT-PCR，由於測量的目標是 mRNA，因此檢測與實際功能的距離更遠。ELISpot 檢測也不受分泌動力學的影響，考慮到有反應的 T 細胞池的非同步性，這是一個重要的事實。對於 ICS 而言，所有細胞都會在預定的時間內被固定殺死。細胞溶解反應介質（如粒酵素 B 和穿孔素）儲存於粒體中，然後在適當的刺激下釋放17-19。由於這種獨特的調控機制，ICS 會錯誤地將所有效應記憶細胞（約佔 T 細胞總數的 20%）識別為穿孔素陽性。或許更重要的是 Lysispot 分析法，這是一種改良的 ELISpot ，能夠透過直接裂解靶細胞來計算 Ag 特異性的細胞毒性 CD8+ T 細胞效應器功能20。在Lysispot分析法開發之前，由於大多數細胞毒性分析都是在大量培養物上進行21，IFNγ ELISpot通常被用來作為CD8+細胞免疫的相關指標22-24。在 HIV 的研究中使用 Lysispot 發現，並非所有產生 IFNγ 的細胞都能殺死25。
T細胞出現的效應器種類繁多，其中一種或多種效應器的表達會因病原類型和受試者的免疫狀態而有很大差異。在結核病 (TB) 診斷領域累積的研究結果顯示，細胞因子特徵的差異可能會更清楚區分無症狀的潛伏感染與活動性感染。活動性病例的快速識別是最重要的，因為這些人對社區構成最大的健康風險26-30。雖然上清液中以微珠為基礎的定量可提供多種參數的分析，但它有其局限性，無法被接受為 TB 及其他疾病的診斷平台。相比之下，ELISpots 可同時（單孔）或平行進行多重分析。使用酵素和螢光方法的雙色 ELISpots 目前已廣泛應用於許多研究領域。螢光 ELISpots 或 FluoroSpots 較比色法具有顯著的優勢，特別是在多重化和自動化斑點偵測方面。
增加雙色以上的多重檢測能力需要螢光背景信號最小的膜表面。
因此，它們會散射光線並顯示高螢光背景。雖然 PVDF 膜（Immobilon®-P 膜）被認為是比硝酸纖維更好的螢光點表面，但 Immobilon®-FL PVDF 膜變體是專為 Western 印迹應用中的螢光檢測而設計的，其螢光背景信號幾乎是標準 PVDF 的 1/100。圖2（圖像）和圖5（第6頁，光點數量）展示了Immobilon®-FL膜在雙色IFNγ/IL-2 FluoroSpots中的使用數據。除了多重化之外，FluoroSpots 還可區分兩種同時測量的功能輸出。多重化也可減少所需的樣品數量。分離式螢光色素的可用性不斷擴大，結合多螢光成像儀器和全自動樣品擷取與資料分析，為透過 ELISpots 分析陽性白血球特異性 T 細胞反應提供了無與倫比的多功能分析框架。
圖 2.在裝有 FluoroSpot 優化 Immobilon®-FL PVDF 膜的 Multiscreen® HTS 板上進行的雙色 IFNγ/IL-2 FluoroSpot 分析的代表性圖像。CEF 池指涵蓋巨細胞病毒、Epstein-Barr 病毒和流感病毒表位的多肽池。
除了膜和板材料之外，板的顏色也會對 FluoroSpot 的成功與否造成很大的影響。圖 3 所示的數據突顯了不同 Multiscreen®HTS 板格式在圖像品質上的差異。IFNγ/IL-2 FluoroSpot 是在有 CEF 肽存在的情況下，在培養（250K/孔）後的 PBMC 細胞上進行的。從嚴格的視覺角度來看，透明板和黑色板上的斑點清晰度大致相同（圖 3A）。相比之下，白色板顯示出高背景信號，使得光點檢測困難，特別是在綠色通道（IFNγ-FITC）。即使大幅縮短曝光時間（約 1/5），仍會出現高背景。高背景很可能是由於與黑色或透明框架相比反射率增加所致，在黑色或透明框架中，光線分別被周圍的平板材料吸收或穿透。點計數的比較顯示，與黑色或透明格式相比，白色版上的點計數顯著減少（圖 3B-C）。同樣地，IFNγ 點的差異更為顯著，觀察到總點數減少了近 80%。如果打孔並分開分析，本底問題可能會消除；然而，如果要進行大型實驗，這可能不太實際。鑒於兩者性能相似，透明板格式提供了更實際的選擇，因為它也方便目視監控試劑的添加。需要注意的是，所有分析均使用 iSpot™ 系統 (AID) 進行。由於性能特性的差異，其他螢光平板閱讀器可能無法顯示相同的平板偏好。
圖 3.所示為使用 Mabtech 的 FluoroSpot 試劑盒在三種不同 Multiscreen®HTS 板格式（透明、黑色和白色）的總 PBMC 上進行 IFNγ/IL-2 FluoroSpot 的雙色代表性孔圖像。對於 CEF 刺激孔，顯示的是各個細胞因子的圖像以及覆蓋圖像。對於未受刺激的孔，僅顯示 IFNγ 單色數據。(B) 圖表顯示三種培養條件下每種平板格式的總和資料。每個橫條分為三個部分 - IFNγ、IL-2 及雙重反應點。所有橫條代表 3 次重複的平均值。(C) 兩個柱狀圖顯示所測量的各細胞激素的比較斑點資料。所有條形圖代表 3 個重複本的平均值。
Unlike flow cytometry, where instrument priming can result in sample loss, every cell in an ELISpot is measured.此外，ELISpot 平均每次測試所需的細胞數量只有流式細胞儀的十分之一，在樣本珍貴（偏遠地區）和/或受限（兒科或免疫抑制的測試對象）的情況下，具有極為重要的優勢。96 孔微孔板長期以來的一個問題是，在小規模檢測（例如單一病患樣本的診斷分析）中，未使用的孔會造成浪費。28 我們提供專為診斷界設計的 8 孔板條（產品編號 M8IPS4510）；這種格式對資源有限的國家特別有吸引力，因為在這些國家，結核病和 HIV 等疾病的肆虐程度最為嚴重（圖 4A）。 28 該板條採用透明格式，適用於 FluoroSpots 以及標準酵素選項，其性能與標準 96 孔板不相上下（圖 4B、5）。8孔試紙條目前是Oxford Immunotech的T-SPOT.TB測試的一部分，T-SPOT.TB測試是FDA認可的IFNγ ELISpot測試，專門用於診斷結核感染。
圖 4.(A) 專為診斷 ELISpot 設計的膜底 8 孔條板。此格式是 T-SPOT.TB (Oxford Immunotech) 的一部分，T-SPOT.TB 是市售的 IFNγ ELISpot 試劑盒，專門設計用來診斷結核感染。(B)在 8 孔條中進行雙色 FluoroSpot 的代表性圖像（單色和覆蓋）。IFNγ/IL-2 FluoroSpot 在未經處理的健康 PBMC 上進行，並在 CEF 多肽刺激後進行。所有檢測均使用 FluoroSpot 試劑盒（Mabtech）進行。
圖 5.8 孔板的表現與標準 96 孔 MultiScreen® 板相似。柱狀圖顯示每種格式在三種培養條件下的總和數據。每個柱狀圖分為三個部分 - IFNγ、IL-2 和雙重反應點。所有柱形代表 3 次重複的平均值。每次檢測使用的細胞數量少得多，這也意味著可以進行多次重複檢測，從而提高統計能力。批量檢測則無法達到這種判別能力。儘管 ELISpot 與流式細胞計測試具有相似的方案步驟，但 ELISpot 資料擷取/分析遠比流式細胞計測試更容易執行，也更省時。事實上，96 孔 ELISpot 試劑板的資料可由影像平台擷取並進行分析，其速度與熟練的流式細胞儀操作員分析一個含有 300,000 個細胞的樣品所需的時間相同。對於某些細胞因子，ICS 的信號雜訊比很低，而且通常是非雙峰分佈，使得選通決定變得隨意且困難。流式細胞計法因缺乏獨立於使用者的亞群分析分選演算法而掙扎，因此受到主觀性和實驗室與實驗室之間差異的影響，而自動化平台則可促進 ELISpot 資料分析的標準化，並提高不同實驗室之間的可重複性31。這些特點的結合也使 ELISpot 成為高通量測試應用的理想選擇，可應用於大規模的受試者分析。例如，IFNγ ELISpot 通常用作疫苗效力的關聯物，以識別 HIV 和其他疾病的潛在候選物32-33。
測試小型化可同時降低細胞需求量，同時提高產量。34 在這個例子中，IFNγ ELISpots 是在 CEF-7 多肽刺激 PBMCs 後進行的。使用 CTL 的 ImmunoSpot® S6 Micro Analyzer 對板進行成像和分析。在測試的播種密度範圍內，檢測顯示斑形成單位 (SFU) 與細胞數呈強烈的線性關係 (R2=0.9866)（圖 6B）。最後，微孔板設計的修改增加了與現有機器人系統的相容性，從而也提高了潛在的產量。這些微孔板改良包括更嚴格的尺寸規格和堅硬的側壁。微孔板現在與標準流體平台、洗板機以及成像和圖像分析裝置完全相容。
圖 6.(A) IFNγ ELISpot 在 384 孔板上對四種種子密度的 PBMC（每層 n=96）進行檢測的代表性圖像。F12 孔已放大以顯示光點的清晰度。(B) 在此圖中，IFNγ 點形成單位 (SFU) 與播種密度對照。每個資料點代表 96 次重複的平均值，誤差條代表標準差。在測試的細胞數量範圍內，該檢測顯示出強烈的線性反應。
ELISpot優化
儘管ELISpot 檢測允許對非常罕見的事件進行頻率釐定，但當(1)含抗原孔中的斑點數偏低，(2)陰性對照孔中的斑點數偏高，尤其是兩者同時發生時，資料詮釋可能會變得含糊不清。因此，即使在使用統計之前，首要任務也必須是優化基本檢測參數和試劑，以最大化信噪比。雖然使用高度特異性的 ELISpot 驗證抗體對是檢測成功的關鍵，但為了確保最佳效能，還需要適當考慮和執行其他一些步驟。本節將介紹標準 T 細胞 ELISpot 分析的概況，特別強調基本關鍵步驟背後的實驗原理，以及排除錯誤或模糊結果的建議。
初步想法
板（膜）的選擇
PVDF 膜板（目錄 Nos.MSIPS4W10, MSIPS4510, MAIPSWU10, MAIPS4510）比混合纖維素酯格式（目錄No.PVDF 板的一個缺點是材料極度疏水，33 此特性可能需要在加入塗層抗體之前用酒精預先濕潤。這一步驟的潛在陷阱將在後面的章節中概述。36,37
陰性/陽性對照
相關對照對於透過 ELISpot 測量抗體特異性反應至關重要。陰性對照通常由沒有刺激物的培養細胞組成，而多克隆 T 細胞活化劑通常用作陽性對照，以確認細胞和檢測功能。陽性對照物包括抗 CD3/CD28 Abs、植物血凝素 (PHA) 和 concanavalin A (ConA)。這些活化劑會誘發許多常見細胞因子的分泌，包括 IFNγ、IL-2 (Th1)、IL-4、IL-5、IL-10 和 IL-13 (Th2)。另一種常見的控制方法是市售的 CEF（巨细胞病毒、Epstein-Barr 病毒、流感病毒）肽池。38
平板組織 - 邊緣效應
平板為 8 行陣列，每行 12 孔。板周邊的孔（第 1 列和第 12 列，A 行和 H 行）與周圍環境的直接接觸更多，因此可能與內部的孔不同。特別是，在長時間培養中，周邊孔的培養基蒸发可能會影響整體檢測性能。在可能的情況下，在真正樣品孔的周邊使用 "media only" 孔可將此影響降至最低。
預濕的問題
先前的比較測試已經證明，適當的乙醇預處理 PVDF-based MultiScreen®HTS板（15 µL新製備的35% v/v乙醇，然後立即用水沖洗）可增加斑點數量（靈敏度更高）和更清晰的斑點（定量更準確）（圖7）35。儘管如此，預濕並非普遍適用於所有 ELISpots；其要求取決於擷取抗體的固有疏水性；因此，在使用前應優化預濕方案35,36。使用更大量的酒精、更長的曝露時間或更濃縮的酒精進行過度處理，可能會導致殘留液體滯留在膜與下排水口之間，這可能會導致檢測性能不佳或更嚴重的井漏。使用沒有下排水孔的 ELISpot 板 (目錄編號 MAIPSWU10)時，不需要擔心酒精預濕造成的滲漏問題；然而，這種格式在長時間培養期間可能會出現培養基蒸发以及基膜外露的無菌問題。另一種選擇是使用親水性膜（如混合纖維素酯）製成的微孔板。還要注意的是，一旦微孔板經過乙醇處理，就必須在整個檢測過程中保持濕潤。
圖 7.(A) 在 PVDF 膜底板上進行小鼠 IFN gamma ELISpot 的代表性孔圖，有乙醇預濕和無乙醇預濕。(B) 顯示 MultiScreen®HTS 試劑板中單孔結構的示意圖。最近的設計變更增加了膜底與底排水頂之間的間距，減少了滲漏的發生。
與擷取抗體塗佈
在傳統的 ELISAs 中，與表面的結合是透過被動吸附發生的，並且需要鹼性條件 (0.2 M 碳酸鈉/碳酸氫鹽 pH>9) 以最大化蛋白質：聚苯乙烯互動的靜電成分。相比之下，用於 ELISpot 的 PVDF 膜的塗層僅由疏水力介導。因此，通常使用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 缓冲液 (pH7.4)。與聚苯乙烯板39相比，膜還能提供顯著更大的結合表面面積 (300X)。為了確保效能，同時最大化成本效益，標準化每孔使用的擷取 Ab 量至關重要。為了達到最佳效能，我們建議同時對塗佈抗體和檢測抗體進行初始滴定。通常，ELISpot 鍍膜的良好起點是每孔 0.5-1 µg Ab（5-10 µ/mL，100 µL）；這比 ELISAs 的輸入量高 5-10 倍。較低的輸入量可能會導致更分散的斑點形態以及斑點數量減少。在驗證新的檢測方案時，特別是在確定定量表達（斑點大小）或低頻事件時，需要分別考慮這兩個參數。Mabtech 提供多種經過充分驗證的 ELISpot Ab 對（塗佈和檢測），可用於人類以及其他物種的檢測（詳情請參閱 www.mabtech.com）。
阻斷步驟
使用擷取抗體孵育後，應大量清洗板子，然後用刺激細胞時使用的相同培養液（200 µL/孔）在 37 °C 下阻斷和平衡 2 小時（減去活化劑）。在封閉培養基後，密封的 PVDF 板可在 4 °C 下存放過夜。儲存時間過長可能導致蛋白沉澱，降低光點解析度。值得注意的是，當板從 4 °C取出並讓其達到室溫時，密封膠帶也必須撕掉，以防止因氣體膨脹而造成洩漏。
Cells - Plating and Stimulation
Fresh vs. Frozen
PBMCs 或富集的 T-cell subsets 構成 ELISpot assays 的主要部分。一旦從血液中純化，PBMC 可以冷凍保存和解凍而不會失去功能活性40。鑑於疾病樣本通常非常珍貴，冷凍保存有多種好處：(1) 可獨立複製資料；(2) 可評估多種分析物質；(3) 可儲存病患樣本並同時進行檢測，從而將潛在的檢測間變異性降至最低。為了以最佳方式回收有活力的細胞，請遵循下列建議：(A) 在凍結期間，混合細胞和凍結液前，先將細胞和凍結液置於室溫；(B) 在解凍期間，為了在清洗解凍細胞時減少滲透性裂解，請在冰上將細胞移至 15 mL 錐形管中，並慢慢加入冷媒。
Benzonase® 核酸酶的優點
使用冷凍 PBMCs 的另一個挑戰是解凍過程中的細胞結塊。結塊通常是由於游離 DNA 和細胞碎片的存在而造成的；它似乎與捐贈者來源和血液處理有關。尤其是當血液在分離 PBMC 前儲存過夜時，結塊發生的頻率更高。36 與從新鮮血液中分離出的相應 PBMCs 的反應相比，隔夜儲存的血液的點計結果顯示出劇烈的下降。為了改善檢測效能，我們建議在解凍程序的前兩個清洗步驟中，在檢測培養基加入能降解所有形式 DNA 和 RNA 的 Benzonase® 核酸酶（產品編號 71205）。使用 Benzonase® nuclease 處理的隔夜血 PBMCs 所得到的結果，更接近從新鮮血液中分離出的細胞所得到的結果。此外，加入Benzonase® nuclease後，細胞活力沒有改變，某些表面標記的表達也沒有改變，包括CD4、CD8、CD38或CD62L。36
細胞計數與存活率百分比的價值
一旦實驗步驟標準化後，每個樣本的量化細胞產量和完整性的差異會成為檢驗變異性的最大來源。細胞總數固然重要，但在建立培養元件時，更需要考慮的關鍵因素是細胞存活率。確定死亡和凋亡細胞的百分比不僅對培養設定很重要，還能提供樣品整體品質的量化資訊。在評估冷凍-解凍過程的成功/失敗時，後一個部分尤其有用。由於使用者的主觀性，手動計數方法（如使用血球計的胰藍排除法）缺乏準確性。此外，這些方法無法提供凋亡部分的量測。透過流式細胞儀使用螢光染料進行自動細胞計數，例如 Muse™ 細胞分析儀和 ViaCount® 試劑，在統計存活細胞方面的精確度優於手動方法。41
Cells Per Well and Replicates
平均而言，T-細胞 ELISpot counts 對於 100,000-800,000 cells5,9-13 範圍內的 PBMCs 呈線性。在可能的情況下，應將細胞進行一式三份的稀釋和培養。不幸的是，由於 96 孔板的孔尺寸限制（0.3 cm2），每孔接種超過 400,000 個細胞可能會造成過度擁擠和細胞堆疊。這會造成細胞間接接觸 Ab 包覆膜而產生擴散斑點。為了最佳監測 Ag 特異性反應者頻率低且需要較高細胞數量的情況，可以在較大的孔中進行檢測，或以最大細胞密度進行複製孔檢測。
在培養期間，我們不建議將板堆疊，因為這會導致板間溫度的變化，並可能造成光點大小和/或數量的差異。
檢測 - 顯色與螢光選項
刺激後，移除細胞，廣泛清洗孔，並應用第二種分析物質特異性抗體。在此步驟及所有後續步驟中，水洗對於徹底去除細胞、非特異性結合的 Ab 及檢測試劑至關重要。未結合試劑未完全去除會導致背景信號的整體增加。
ELISpot 检测既可以使用直接与检测基团（酶或荧光素）共轭的抗体，也可以使用生物素/链霉亲和素共轭的抗体对进行两步法检测。雖然兩步法可因信號放大而提供更大的強度，因此在每細胞細胞因（過敏/Th2 反應）產生量低的情況下較為可取，但此方案也會因與塗層抗體的非特異作用而產生更大的背景染色潛力。對於酵素，例如辣根過氧化酶 (HRP)，可使用沉澱底物 (TMB 或 AEC) 進行點檢測。由於 HRP 的轉換率高，因此光點顯影速度很快 (≤5分鐘)。相比之下，使用鹼性磷酸酶結合的 Abs 的光點顯影速度要慢得多，但背景明顯較低。對於在 MultiScreen®HTS 板（有底液的板）上進行的顯色檢測，建議在添加底物前移除底液；否則會導致高背景染色。移除底物後，應將平板支撐起來，以減少與膜的接觸。為了增強斑點的可視性，平板應在室溫下無蓋、倒置晾乾數小時。
如前所述，與比色法相比，使用螢光結合物具有顯著優勢，特別是在雙細胞因子應用或需要對單個斑點進行更多定量評估的情況下。雖然 FITC 和 Cy3 結合的 Abs 常用，但螢光探針的選擇僅限於結合物和檢測平台的可用性。
光點計數與分析 - 什麼是真正的光點？
每個光點代表單個細胞的「細胞激素特徵」。由於擴散的特性，真正的斑點有一個顏色濃密的中心，然後向邊緣漸漸褪色；斑點的大小和/或顏色強度由釋放的細胞激素量決定。儘管如此，由於所測量的分析物質、孵育時間、抗體濃度、酵素活性、底物和使用的其他材料不同，以及細胞激素分泌細胞的功能狀態不同，光點的大小和密度也會有很大的差異。可能會出現假現斑，可能是由於抗體聚集或細胞及細胞碎片未完全去除所致。
從上述描述來看，光學顯微鏡的手動光點計數可歸類為高度主觀的過程，使用者之間的差異很大。此外，當考慮到在標準疫苗試驗中可能需要量化的孔數，ELISpot 資料分析的任務對人眼來說就變得太費力了。精密的 ELISpot readers 為精確評估斑點資料提供了完整的解決方案。這些儀器具有克服背景強度多變問題的功能，並能夠區分真正的單細胞斑點與偽跡。後者的能力有賴於使用光點大小和強度的最小和最大臨界值，分別允許排除弱的旁觀者反應和包含多個細胞的簇。除了速度之外，ELISpot 分析軟體還能提供流程標準化，這是跨實驗室進行研究的關鍵要素，例如診斷測試和疫苗試驗。此外，ELISpot 閱讀器和分析軟體為更精確的斑點測量打開了大門，允許以每個細胞為單位定量測量多種細胞因子的分泌。
1.高水平的背景染色
2.無斑點/空白井
3.模糊/定義不清/不流利的點
鳴謝
我們感謝 Tomas Ernemar (Mabtech) 提供所有 FluoroSpot 資料以及稿件審閱。384 孔數據由 Jodie Hansen (CTL) 慷慨提供。我們也要感謝 Sylvia Janetzki (ZellNet Consulting) 的稿件審查。
參考資料
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