使用 TempliPhi™ 進行迴圈 DNA 擴增

Cytiva 的illustra™ TempliPhi™ DNA Amplification Kits 是新開發的產品，可透過 RCA 以指數方式擴增單鏈或雙鏈環狀 DNA 範本，示意圖如下圖 7.3所示。擴增的產品可用於下游應用，如測序和分子克隆。TempliPhi^™ DNA Amplification Kit 提供針對環狀 DNA 擴增最佳化的 RCA 試劑。該反應利用改良的隨機引物，在單步等熱反應中，由流程極快、保真度極高的 Phi29 DNA 聚合酶高效地進行引物合成。

TempliPhi^™擴增的起始材料可以是多種來源--含有質粒的少量細菌細胞、分離出來的質粒、完整的 M13 噬菌體或任何環狀 DNA（包括結合反應）都能被有效地擴增。可從瓊脂平板上挑出細菌菌落，加入樣品緩衝液中，然後加熱以釋放細胞中的質粒 DNA。聚合酶可直接加入此材料中以啟動擴增反應。另外，也可以使用亞微升量的飽和細菌培養物或甘油儲備液。根據起始材料的來源，擴增反應可在 30 °C 下 4 到 18 小時內完成，不需要熱循環。TempliPhi^™ 反應的產物是高分子量、雙鏈、串聯重複的環狀模板拷貝。請注意，當 M13 克隆是來源材料時，TempliPhi^™ 的產物是雙股 DNA，可用正向和反向引物進行測序。

使用 TempliPhi^™ 方法擴增的 DNA 可直接用於許多後續應用，包括循環測序反應、限制性酵素分析、DNA 克隆程序，以及取代超螺旋質粒 DNA 的 體外 轉錄反應。illustra TempliPhi^™ DNA Amplification Kit 用於直接從環狀 DNA 製備 DNA。 illustra TempliPhi^™ Large Construct DNA Amplification Kit 專為大型 DNA 載體 (e.g.、illustra TemliPhi HT DNA Amplification Kit 專為高通量使用而設計 (超過 1000 preps/wk)。illustra TempliPhi^™ Sequence Resolver Kit 的設計是為了產生不同類型的 DNA，更容易測序，解決最常見的測序問題，並實施簡化的方案，步驟更少，不需隔夜培養。

使用 TempliPhi^™ Amplification Kit 進行 DNA 擴增的方案如下。

材料

隨產品提供樣品緩衝液、反應緩衝液、混合酶和陽性對照 DNA

熱循環器或水浴，可在 30 ℃、65 ℃ 和 95 ℃ 下孵育

適用於單拷貝數或低拷貝數的 BAC 和 fosmids：鹼性裂解試劑（請參閱產品說明書）

預先準備

冰上解凍樣品緩衝液和反應緩衝液。

程序

1.將樣本緩衝液與模板 DNA† 混合

2.在 95 °C 下變性樣本並冷卻

此步驟會充分裂解細菌細胞或噬菌體微粒，以釋放環狀模板到液體中。

避免在較高溫度下加熱或加熱超過 3 分鐘，因為這會釋放出細菌 DNA，在擴增過程中與所需模板競爭。準備酵素母液

為所有擴增反應準備母液.

4. 轉移到冷卻的樣品

將酵素母液轉移到冷卻的樣品.

5.在 30 °C 下孵育

DNA 在此步驟中進行擴增。時間會因輸入 DNA 的量和所需輸出 DNA 的量而異 (4 到 18 小時).

6.熱滅活酵素

在 65 °C 下短暫孵育以滅活酵素。冷卻至 4 °C。

失活 DNA 聚合酶活性可防止對後續循環測序反應的潛在干擾。失活校對外切酶活性可防止模板 DNA 在儲存過程中降解。

^†建議使用鹼性裂解來變性含有低拷貝數 BAC 和 fosmids 的培養物，以減少熱降解造成的 DNA 碎片；對於含有質粒或 M13 phage 的培養物，則不需要這樣做。