人類毛囊真皮乳頭細胞 (HFDPC) 培養規範

培養前準備

培養 HFDPC

分離培養 HFDPC

材料

I.儲存

A.低溫保存瓶 (602-05a)

低溫保存瓶一經運抵，立即存放於液氮儲存槽中。

*從液氮儲存槽中取出低溫保存瓶時，請務必戴上面罩和手套。從儲存槽到室內的劇烈溫度變化可能導致冷凍瓶中滯留的液氮爆裂並造成傷害。

人類毛囊真皮乳頭細胞 (HFDPC)

II.培養前的準備

1. 確保具有 HEPA 過濾層流氣流的 Class II 生物安全櫃處於正常工作狀態。
2. 用 70% 酒精消毒生物安全櫃。
3. 開始細胞培養工作前，將生物安全櫃的鼓風機打開 10 分鐘。
4. 確保所有血清移液器、移液器吸頭及試劑溶液均為無菌。
5. 遵循標準的消毒技術和安全規則：
   a.    不要用口移液。b.     即使所有菌株的 HIV、乙型肝炎和丙型肝炎檢測結果均為陰性，在使用人體細胞時，務必戴手套和安全眼鏡。
   c.    在無菌罩中處理所有細胞培養工作。

III.培養 HFDPC

A.準備培養 HFDPC 的細胞培養瓶

1. 從冰箱中取出 Collagen Coated T-75 Flask (125-75)和 Hair Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium (611-500)，使其平衡至室溫。
2. 在無菌罩中用 70% 酒精消毒瓶和燒瓶。
3. 用移液管吸取 15 mL 的 毛囊真皮乳頭細胞生長培養基 (611-500)* 到 膠原塗層 T-75 燒瓶 (125-75)中。
   *保持培養基與表面面積的比例為每 5 cm².
   -  5 mL 用於 T-25 燒瓶 (SIAL0639) 或 60 mm 組織培養皿 (SIAL0166)。
   -  15 mL 用於 T-75 燒瓶 (SIAL0641) 或 100 mm 組織培養皿 (SIAL0167).

B。解凍和接種 HFDPC

1. 準備一個 15 mL 的無菌錐形管，加入 12 mL 的 毛囊真皮乳頭細胞生長培養基 (611-500)，以清洗 HFDPC。
2. 使用適當的眼睛和手部保護措施，從液氮儲存槽中取出冷凍保存的小瓶 HFDPC。
3. 將小瓶的下半部分放入37 °C的水浴中快速解凍細胞，並在解凍過程中密切觀察小瓶。不要讓細胞完全解凍。
4. 從水浴中取出小瓶並擦乾。
5. 在無菌生物安全櫃中用 70% 酒精對小瓶外部進行去污。
6. 用 2 mL 移液管輕輕地移動細胞 5 次，將細胞分散在小瓶中。
7. 將小瓶中的細胞懸液（1 mL）輕輕地移入準備好的15 mL錐形管中。
8. 將上清液從管中抽出，不要打亂細胞球。
9. 將細胞重懸在2 mL的 毛囊真皮乳頭細胞生長培養基 (611-500)中，用移液器輕輕地移動細胞，使其團塊破碎。
10. 將2mL細胞懸液轉移到含有15mL毛囊真皮乳頭細胞生長培養基的T-75膠原塗層瓶(125-75)中。
11. 蓋緊瓶蓋，輕輕旋轉培養瓶，使細胞均勻分佈在培養瓶中。
12. 將 T-75 培養瓶放入 37 ^oC，5% CO₂ 加濕培養箱中。
13. 每隔一天更換一次 毛囊真皮乳頭細胞生長培養基 (611-500)，直到細胞達到 60% 融合。
14. 當培養達到 60% 匯合或週末餵養時，加倍 Hair Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium (611-500) 的容量。
15. 當 HFDPC 達到 80% 匯流時，對細胞進行分培。

IV.亞培養 HFDPC

A.製備亞培養試劑

1. 從 -20 °C 冷凍庫中取出胰蛋白酶-EDTA 溶液和胰蛋白酶抑制劑，並在冰箱中解凍過夜。
2. 確保所有亞培養試劑均已解凍。輕輕攪拌每瓶試劑數次，以形成均勻的溶液。
3. 將所有亞培養試劑儲存於 4 °C，以備日後使用。
4. 如果只需要一部分 胰蛋白酶/EDTA溶液 (T3924)，請將未使用的部分儲存於-20 °C。準備培養瓶
   1. 攪拌 膠原塗層溶液 (125-50)瓶幾次，形成均勻的溶液。
   2. 從冰箱中取出 毛囊真皮乳頭細胞生長培養基 (611-500)。
   3. 在T-225燒瓶(CLS431082)中加入10 mL膠原塗料溶液(125-50)，輕輕搖動燒瓶，使溶液均勻地分布在整個培養面上。
   4. 在室溫下塗佈培養皿 1-2 小時。
   5. 在無菌罩中抽吸除去 膠原蛋白包被液 (125-50)。
   6. 用 Dulbecco's 磷酸緩衝鹽水 (D8537)清洗包被瓶三次，並在最後一次清洗中完全吸出瓶中的溶液。鍍膜燒瓶可立即使用，或放入密封袋中於 4 °C 儲存 2 週。
   7. 將45 mL的 Hair Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium (611-500)移入此包被的 T-225 flask (CLS431082)中，等待接種，為亞培養做好準備。

   B。HFDPC 的分培

   在室溫下胰蛋白酶化細胞。請勿加熱任何試劑至 37 °C。

   1. 吸出培養瓶中的培養基。
   2. 用 HBSS (H6648)清洗單層細胞，吸出溶液。
   3. 用移液管移取 5 mL 的 胰蛋白酶/EDTA 溶液 (T3924) 到 T-75 燒瓶中。
   4. 立即移除 4.5 mL 溶液。
   5. 重新蓋緊瓶蓋，在室溫下倒置顯微鏡下監測胰蛋白酶化的進程。
   6. 用手掌拍打瓶側，直到大部分細胞脫離，從培養液表面釋放圓形細胞。
   7. 將培養瓶中的細胞懸液轉移到 50 mL 無菌錐形管中。
   8. 再用 5 mL 的胰蛋白酶抑制劑溶液 (T6414)沖洗培養瓶，並將溶液轉移到同一錐形管中。
   9. 在顯微鏡下檢查 T-75 培養瓶。
   10. 將錐形管以 220 x g 離心 5 分鐘，使細胞沉澱。
   11. 將上清液從管中抽出，不要打擾細胞沉澱。
   12. 用手指輕彈圓錐管的頂端，鬆開細胞團。
   13. 將細胞重懸在 2 mL 的毛囊真皮乳頭細胞生長培養基(611-500)中，用移液器輕輕地移動細胞，使其團塊破裂。快速生長時接種 10,000 cells per cm² ，定期分次培養時接種 6,000 cells per cm² 。