人類表皮角質細胞 (HEK) 培養規範

培養 HEK
Subculturing HEK

I.儲存

A.低溫保存瓶 (102-05n, 102-05f, 102-05a)

低溫保存瓶到達後，請立即存放在液氮儲存槽中。

*從液氮儲存槽中取出低溫保存瓶時，請務必戴上面罩和手套。從儲存槽到室內的劇烈溫度變化可能導致冷凍瓶中滯留的液氮爆裂並造成傷害。

圖 1. 人類表皮角質細胞 (HEK)

II.培養前的準備

1. 確保具有 HEPA 過濾層流氣流的 Class II 生物安全櫃處於正常工作狀態。
2. 用 70% 酒精消毒生物安全櫃。
3. 開始細胞培養工作前，將生物安全櫃的鼓風機打開 10 分鐘。
4. 確保所有血清移液器、移液器吸頭和試劑溶液均為無菌。
5. 遵循標準的消毒技術和安全規則：
   a. 不要用嘴移液。請勿用口移液。
   b．使用人類細胞時，即使所有菌株都已
       經過 HIV、乙型肝炎和丙型肝炎測試呈陰性反應，也一定要戴手套和安全眼鏡。在無菌罩中處理所有細胞培養工作。

III.培養 HEK

A.準備培養 HEK 的細胞培養瓶

1. 從冰箱中取出胎兒和新生細胞的無血清角質形成細胞生長培養基 (131-500)*。
2. 用移液管吸取15 mL胎儿和新生儿细胞的无角质细胞血清生长培养基 (131-500)**到T-75烧瓶中。
   * 如果使用 306-05a, Human Epidermal Keratinocytes, HEK, adult (106-05a)，本程序的所有步骤均使用 Keratinocyte Serum-Free Growth Medium for adult cells (131-500a)。
   ** 保持培養基與表面面積的比例為每 5 cm².
   例如：
   -  5 mL 用於 T-25 燒瓶  或 60 mm 組織培養皿。
   -  15 mL 用於 T-75 燒瓶或 100 mm 組織培養皿(SIAL0167).

B.解凍和移植 HEK

1. 使用適當的眼睛和手部保護措施，從液氮儲存槽中取出低溫保存的 HEK 小瓶。
2. 將小瓶蓋轉動四分之一圈，以釋放可能滯留在螺紋中的任何液氮，然後將蓋子重新鎖緊。
3. 將小瓶的下半部放入 37 °C 水浴中快速解凍細胞，並在解凍過程中密切觀察小瓶。
4. 在無菌生物安全櫃中用 70% 酒精去除小瓶外部的污染。請勿用手觸摸瓶蓋邊緣或小瓶，以免污染。
5. 用 2 mL 移液管輕輕地移動細胞 5 次，重悬小瓶中的細胞。
6. 將小瓶中的細胞懸浮液（1mL）移入盛有15 mL胎兒和新生細胞的角質形成細胞無血清生長培養基（131-500）的 T-75 燒瓶 (SIAL0641)中。
7. 蓋上瓶蓋，輕輕搖動，使細胞均勻分佈。
8. 將T-75容量瓶置於37 °C、5% CO₂ 加濕培養箱中。鬆開瓶蓋以進行氣體交換。
9. 24小時後或隔夜換上新鮮的 Keratinocyte Serum-Free Growth Medium for fetal and neonatal cells (131-500)，以去除所有DMSO的痕跡。
10. 隔天更換適用於胎兒和新生細胞的 Keratinocyte Serum-Free Growth Medium (131-500)，直到細胞達到 45% 匯合度。
11. 當培養達到 45% 匯合或週末餵養時，將胎兒和新生細胞用的 Keratinocyte Serum-Free Growth Medium (131-500) 的容量加倍。
12. 當 HEK 培養達到 80% 匯合時，再培養細胞。

IV.亞培養 HEK

A.準備亞培養試劑

1. 從 -20 °C的冷凍庫中取出 胰蛋白酶-EDTA溶液 (T3924)和 胰蛋白酶抑制劑 (T6414)，並在冰箱中解凍過夜。
2. 確保所有亞培養試劑均已解凍。輕輕攪拌每瓶試劑數次，以形成均勻的溶液。
3. 將所有亞培養試劑儲存於 4 °C，以備日後使用。
4. 如果只需要一部分 胰蛋白酶/EDTA溶液 (T3924)，請將未使用的部分儲存於-20 °C。準備培養瓶
   1. 從冰箱中取出胎兒和新生兒細胞用的 角質細胞無血清生長培養基 (131-500)。在無菌罩中用 70% 酒精消毒瓶子。
   2. 用移液管吸取35 mL胎儿和新生儿细胞用的无角质细胞血清生长培养基 (131-500)到T-175烧瓶中（将在第四部分C步骤15中使用）

   C.HEK 的亞培養

   在室溫下胰蛋白酶化細胞。

5. 用 HBSS (H6648)清洗單層細胞，並吸去溶液。
6. 用移液管吸取 8 mL 胰酶/EDTA 溶液(T3924)到 T-75 烧瓶(SIAL0641)中。轻轻摇晃烧瓶，确保溶液覆盖所有细胞。
7. 重新盖紧烧瓶盖，在室温下倒置显微镜下观察胰蛋白酶化过程。
8. 噴霧 胰蛋白酶/EDTA溶液 (T3924)。
9. 重新蓋上瓶蓋，放入37 °C 孵育箱中2分鐘。
10. 用手掌撞擊圓瓶的側面，直到大部分細胞脫離，從培養表面釋放圓形細胞。
11. 如果目視上細胞沒有脫離，將圓瓶放入培養箱中再培養 30 秒鐘，然後重複步驟 7。
12. 用移液器移取5 mL胰蛋白酶抑制劑溶液(T6414)至培養瓶中，以抑制胰蛋白酶活性的進一步發展。
13. 將培養瓶中的細胞懸液移至50 mL無菌錐形管中。
14. 用另外 5 mL 的 胰蛋白酶抑制劑溶液 (T6414)沖洗燒瓶，並將溶液轉移到同一個錐形管中。
15. 在顯微鏡下檢查 T-75 燒瓶。
16. 將圓錐管以 220 x g 離心 5 分鐘，使細胞沉澱。
17. 噴出管中的上清液，不要打亂細胞沉澱。
18. 將細胞重悬於 2 mL 適用於胎兒和新生細胞的 Keratinocyte Serum-Free Growth Medium (131-500)中，用移液器輕輕地移動細胞，使其團塊破裂。
19. 使用血球計或細胞計數器計數細胞。快速生長時接種 7,500 cells per cm² ，定期分次培養時接種 5,000 cells per cm² 。