荧光原位杂交（FISH）

试剂和设备

1. 20X 柠檬酸钠缓冲液（SSC：3 M NaCl，0.3 M柠檬酸钠，pH 7，货号S6639）
2. RNase A（货号R4642）100 µg/mL，2x SSC溶液
3. 胃蛋白酶（货号P6887） 40单位/ml，10 mM HCl溶液
4. 多聚甲醛，EM级（货号P6148），现制，4% w/v水溶液
5. 乙醇
6. 标记的探针。通过缺口平移随机引物或 A3803聚合酶链反应（如ADVANCE™缺口平移试剂盒）而对质粒DNA进行生物素-11-dUTP标记
7. 杂交混合液：50％甲酰胺（货号F7508）、10％硫酸葡聚糖（货号D8906）、0.1％ SDS（货号L4390）、0.5-1.5 ng/µl标记的探针和300 ng/mL鲑鱼精子DNA（货号D7656），2x SSC溶液
8. 洗涤缓冲液：20％甲酰胺（货号F7508），0.1x SSC溶液
9. 检测缓冲液：0.2% Tween 20（货号. P1379），4x SSC溶液
10. 封闭缓冲液：5% 牛白蛋白（货号A3803），检测缓冲液溶液
11. 抗体或检测化合物（如链霉亲和素-Cy3，货号S6402），封闭缓冲液溶液
12. DAPI（货号D9542），2 µg抗荧光淬灭封片剂溶液。
13. 荧光显微镜、滤光片和可选的三带通滤波器（x58，Omega Optics）
14. 玻片（货号S8400）
15. 用于孵育和杂交步骤的塑料盖玻片（从可高压灭菌的垃圾袋切下，如货号B4408）
16. 热模块/ 改进的热循环仪
17. 用于洗涤步骤的科普林缸（货号S6016、S5641 或S5891）

操作流程

玻片制备
杂交
检测

玻片制备

1. 从任何细胞类型开始染色体制备。
2. 在37 °C下用200 µL RNase孵育1小时
3. 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。
4. 在10 mM HCl中漂洗玻片。
5. 在37 °C下用200 µL胃蛋白酶孵育10分钟。
6. 在去离子H₂O中漂洗玻片。
7. 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。
8. 在多聚甲醛中固定玻片10分钟。
9. 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。
10. 在梯度乙醇中对玻片进行脱水：70%、80%、95%；每种2分钟。
11. 风干。

杂交

1. 每块玻片制备30 µl杂交溶液。加热至70 °C，维持10分钟后置于冰上。
2. 每块玻片上加入30 µl杂交溶液并盖上塑料盖玻片。
3. 在热模块上65-70 °C条件下对玻片进行变性5分钟。
4. 逐渐降温至37 °C。
5. 在湿度箱37 °C条件下杂交过夜。

检测

1. 在2x SSC中洗涤玻片以去除盖玻片。
2. 在洗涤缓冲液中40 °C条件下洗涤玻片5分钟。重复。
3. 在0.1x SSC中40 °C条件下洗涤玻片5-15分钟。
4. 在2x SSC中40 °C条件下洗涤玻片5-15分钟。
5. 将玻片冷却至室温。
6. 在检测缓冲液中平衡玻片5分钟。
7. 在封闭缓冲液中封闭20-30分钟。
8. 用50 µl 抗体或检测化合物孵育30-60分钟（如在封闭缓冲液中的5 µg/ml 链霉亲和素-Cy3）。
9. 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复两次。
10. 用DAPI溶液复染10分钟。
11. 简短漂洗后在抗荧光淬灭封片剂中进行封片。
12. 用荧光显微镜进行分析。
    

参考文献

1. Heslop-Harrison J, Schwazarcher T, Anamthawat-Jónsson K, Leitch AR, Shi M. 1991. In situ hybridization with automated chromosome denaturation. Technique. 3109-15.

2. Leitch AR. 1994. In situ hybridization : a practical guide. Oxford (England): BIOS Scientific Publishers.

3. Harris N, Oparka KJ. 1994. Plant Cell Biology: A Practical Approach. Oxford (England): Oxford University Press.