采用LentiBrite™ 慢病毒生物传感器进行细胞骨架蛋白的荧光活细胞成像

简介

过去15年，随着荧光蛋白(GFP/RFP)和细胞结构蛋白遗传编码融合的不断发展完善，亚细胞结构动力学细胞分析已经发生了翻天覆地的变化。作为由微管蛋白和肌动蛋白亚基组成的动态细胞骨架丝，微管在有丝分裂期间（有丝分裂纺锤体中）发挥着中心作用，并且在间期可作为定向驱动蛋白和动力蛋白介导细胞物质运输的支架。若干微管结合剂家族，如紫杉烷和长春花生物碱，可破坏微管动力学并导致细胞死亡，成为临床上有效的化学治疗剂。在活细胞中通过微管动力学成像来表达带有荧光蛋白标记的微管蛋白有利于大大加深我们对微管结合剂的理解。

我们利用LentiBrite™慢病毒生物传感器对微管蛋白（α-tubulin）、肌动蛋白微丝（β-actin）、微丝交联位点（α-actinin）、中间丝（vimentin）以及焦点粘连（paxillin）进行可视化。我们已证明这些生物传感器经验证可配合固定和活细胞荧光显微镜使用，不会干扰目标结构。通过免疫细胞化学确定GFP或RFP标记蛋白的定位与内源蛋白一致，这些生物传感器在用已知细胞骨架结构调节剂处理后显示出特征性重排。因此，这组慢病毒生物传感器提供了一种在各种生理和病理治疗条件下，在终点和实时活细胞成像模式中对细胞骨架结构和动力学进行可视化的方法。

LentiBrite™活细胞视频

使用LentiBrite™荧光生物传感器进行自噬的活细胞成像

采用LentiBrite™荧光生物传感器进行β-肌动蛋白细胞骨架蛋白的活细胞成像

采用LentiBrite™荧光生物传感器进行p62的活细胞成像

方法

编码荧光蛋白融合体的慢病毒载体构建

编码TagGFP2和TagRFP的cDNA从Evrogen获得。通过在荧光蛋白cDNA的C末端克隆人微管蛋白α-1B的全长cDNA序列构建LentiBrite™ RFP-和GFP-α-微管蛋白。通过在荧光蛋白cDNA的C末端克隆人β-肌动蛋白的全长cDNA序列来构建LentiBrite™ RFP-和GFP-β-肌动蛋白。通过在荧光蛋白cDNA的C末端克隆人β-肌动蛋白的全长cDNA序列来构建LentiBrite™ RFP-和GFP-β-肌动蛋白。通过在荧光蛋白cDNA的C末端克隆人vimentin蛋白的全长cDNA序列构建LentiBrite™ GFP-和RFP vimentin。通过在荧光蛋白cDNA的N-末端克隆人α-辅肌动蛋白-1异构体b的全长cDNA序列构建LentiBrite™ α-辅肌动蛋白-GFP和-RFP。  将构建体转移至pCDH-EF1-MCS，一种含有组成型、中度表达EF1α启动子的慢病毒载体。使用pPACKH1 Lentivector包装系统生成第3代基于HIV的VSV-G假型慢病毒颗粒。

细胞接种及慢病毒转导

将生长培养基中的细胞接种到8孔玻璃室载玻片上,用于固定和活细胞成像。选择接种密度以在过夜培养后提供50-70％的汇合度（如20,000-40,000个细胞/cm²）。接种后第二天，更换新鲜的生长培养基。将高滴度慢病毒原液用生长培养基进行1:40的稀释，并将适当体积的慢病毒加入到接种的细胞中以达到所需的感染复数（MOI）。MOI是指感染性慢病毒颗粒的数量与被感染细胞的数量的比率。典型的MOI值范围为10至40。然后将感染的细胞在37 °C、5％CO 2下孵育24小时。在慢病毒转导后24小时，除去含有慢病毒的培养基并用新鲜生长培养基进行替换。将细胞再培养24-48小时，每24小时更换培养基。对于抑制剂实验，将细胞在感兴趣的抑制剂中以图例中所示的浓度和时间进行孵育。

活细胞成像及抗体染色

对于活细胞的可视化，用含有10％胎牛血清（FBS）和25mM HEPES的杜氏改良Eagle培养基（DMEM）代替生长培养基。将腔室盖玻片放置在Leica DMI6000B倒置宽视野荧光显微镜上的温控显微镜载物台上，该显微镜具有63X油镜和适于GFP或RFP可视化的照明及滤光器系统。在添加调节剂后尽可能快地开始进行成像。

对于终点成像，将腔室载玻片中的细胞在室温下用含有3.7％甲醛的杜氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）固定30分钟。在固定期间和所有的后续步骤中，保护细胞免受光照以使光漂白最小化。然后用荧光染色缓冲液（具有2％封闭血清和0.25％Triton^® X-100的DPBS）冲洗样品两次。将荧光染色缓冲液中的一抗加入至各孔中，并在室温下孵育1小时。然后用荧光染色缓冲液冲洗样品三次，然后在室温下用荧光二抗和染色缓冲液中的DAPI（1 μg/mL）孵育1小时。然后用荧光染色缓冲液（具有2％封闭血清和0.25％Triton® X-100的DPBS）冲洗样品两次。

结果

通过慢病毒转导实现更佳的生物传感器表达效率

我们构建了一组慢病毒颗粒，其中含有用于细胞骨架元件的遗传编码荧光标记。通过使用这些慢病毒生物传感器，与质粒DNA的化学转染相比，转染效率和均质性都得到极大改善（图1）。

图 1. 在易转染和难转染细胞类型中得到的质粒与慢病毒转染结果。通过采用质粒DNA结合脂质体转染试剂或LentiBrite™慢病毒颗粒的方法，将TagGFP2-微管蛋白表达的载体转染进HeLa和HUVEC细胞中。通过使用宽场荧光成像以及20X物镜获得（蓝色 = DAPI核复染，绿色 = GFP-微管蛋白）图像。慢病毒转导可实现更好的转染效率（特别是质粒转染不成功的HUVEC）以及更为均一的GFP-微管蛋白荧光信号强度。

一组用于细胞骨架元件的慢病毒编码活细胞生物传感器

图 2. LentiBrite™慢病毒生物传感器定位特定细胞骨架元素。(A) GFP-paxillin显示REF-52细胞的焦点粘连。(B) REF-52细胞中的 α-肌动蛋白-RFP展示出与肌动蛋白微丝交联点相对应的条纹丝模式。(C) REF-52中的β-肌动蛋白-RFP展现出与α-肌动蛋白相似的丝状模式，但是具有持续强度的模式。(D) HUVEC中的RFP-α-微管蛋白展现出从微观组织中心散射出的微观丝状模式（白色箭头）。(E) 人类MSC中的GFP-波形蛋白显示中间丝。

慢病毒递送生物传感器的特异性及定位

由于遗传编码生物传感器易发生不当定位、特定荧光蛋白聚集或目标结构过度表达生物传感器过饱和，我们试图证实慢病毒递送生物传感器定位的特异性。我们发现慢病毒递送荧光蛋白标记的细胞骨架标记，能够准确检测合适的细胞骨架元件，可通过以下方法确定：1）在采用细胞骨架结构特异性抑制剂处理细胞后，测定生物传感器的重新分布；2）免疫荧光法测定生物传感器与内源蛋白的类似分布；3）活细胞细胞骨架动力学成像。

图 3. 在经过调节剂处理后进行RFP标记微管蛋白定位。以MOI 40对HUVEC进行RFP-微管蛋白生物传感器病毒转导。转导后的细胞分别如下处理4h：(A) 未处理，(B) 用1 μM紫杉醇处理，或(C) 25 μM诺考达唑处理。细胞经过固定、封固并采用宽场荧光显微镜进行成像。经紫杉醇处理的细胞在细胞核周围呈现出弯曲成捆状微管，而用诺考达唑处理的细胞并没有包含明显的微管结构。

图 4. 荧光抗体法研究荧光蛋白表达及共定位。用MOI 20的条件对HeLa细胞进行TagREP-波形蛋白生物传感器转导，并在72小时以后对其进行25uM诺考达唑处理并设置未处理对照。随后，将细胞固定并用抗波形蛋白抗体进行免疫染色，通过宽场显微镜进行成像。未处理细胞展现出丝状的波形蛋白波形蛋白网络，而诺考达唑处理的细胞形成了堆叠的环核分布。在这两种情况下，荧光标记蛋白（上方及中间箭头）与抗波形蛋白抗体（底部箭头）染色进行共定位。

图 5. β-肌动蛋白慢病毒转导细胞的活细胞延时成像。β-肌动蛋白慢病毒转导细胞的活细胞延时成像。细胞中加入2 uM细胞松弛素D并立即开始进行成像，在30分钟内每30秒捕获图像。静帧图片表明细丝状组织在细胞核附近转变为颗粒状，并在细胞周围扩散分布。

结论

慢病毒生物传感器能够利用荧光蛋白标记的亚细胞标记物，方便地对易于转染和难以转染的细胞类型进行转导。与非病毒转染方法相比，这些LentiBrite™预包装的慢病毒颗粒能够实现更高的效率和更均匀的外源蛋白表达。我们已经演示了如何在固定和活细胞显微镜应用中使用GFP或RFP标记的细胞骨架标记物。编码蛋白显示出与抗体染色共定位，并在用已知的细胞骨架结构调节剂处理后适当重新分布。LentiBrite™生物传感器为寻求荧光可视化蛋白在正常、异常、患病或诱导细胞状态下的存在、缺失或运输的研究人员提供了一种即用型解决方案。