Systemy ekspresji białek

Wprowadzenie

Rozwój inżynierii genetycznej i klonowania otworzył wiele możliwości ekspresji i izolacji heterologicznych białek do celów badawczych. Znaczny postęp technologiczny umożliwił ekspresję i izolację białek rekombinowanych na dużą skalę. Jednak w przypadku zastosowań na dużą skalę, takich jak produkcja enzymów, przeciwciał lub szczepionek, wymagana ilość białka jest znacznie wysoka. W takich przypadkach system, w którym białko ulega ekspresji, musi być łatwy w hodowli i utrzymaniu, szybko rosnąć i wytwarzać duże ilości białka. Co więcej, białka ssaków podlegają również różnym modyfikacjom potranslacyjnym. Wymagania te doprowadziły do odkrycia systemów ekspresji białek. Różne systemy ekspresji białek to bakterie, drożdże, owady lub ssaki.

Następujące czynniki determinują rodzaj systemu ekspresji stosowanego do produkcji rekombinowanych białek:

• czas poświęcony na ekspresję białka
• łatwość obsługi systemu ekspresji
• ilość potrzebnego białka
• masa białka
• rodzaj modyfikacji post-translacyjnychrodzaj modyfikacji potranslacyjnych, liczba wiązań dwusiarczkowych
• przeznaczenie wyrażonego białka

Proces wyrażania rekombinowanego białka w systemie ekspresyjnym wymaga następujących informacji/składników.

• identyfikacja genu kodującego interesujące nas białko
• generacja cDNA z odpowiedniego mRNA
• wybór odpowiedniego wektora ekspresyjnego do wprowadzenia sekwencji genu
• wybór odpowiedniego systemu, który może wyrazić wektor
• odpowiednie metody badań przesiewowych i skalowania

Podstawowe kroki związane z produkcją pożądanego białka rekombinowanego są podobne w różnych systemach ekspresji (Rysunek 1).

Rysunek 1. Kroki związane z optymalizacją systemu ekspresji białek w celu wytworzenia pożądanego białka rekombinowanego

Bakteryjne systemy ekspresji białek - Escherichia coli

Bakterie działają jako szybkie i proste systemy ekspresji rekombinowanych białek ze względu na krótki czas podwojenia. Pożywki wymagane do ich hodowli nie są drogie, a metody dostosowane do zwiększania skali bioprodukcji są proste. Najczęściej stosowanym systemem gospodarza jest E. coli, ponieważ istnieje obszerna wiedza na temat jego genetyki, sekwencji genomu i fizjologii. Manipulacja genetyczna jest łatwa, a bakteria rośnie do dużych gęstości i nadaje się do fermentacji na dużą skalę. Jednak ściana komórkowa E. coli zawiera toksyczne pirogeny, a wyrażone białka mogą wymagać intensywnych testów przed użyciem.

Rysunek 2. Bakteryjny system ekspresji białek - Escherichia coli

Ekspresja białka przy użyciu E. coli obejmuje następujące etapy:

• użycie kompetentnych E. coli  (numery katalogowe CMC0001, CMC0004, CMC0014) komórek w celu pobrania sekwencji DNA będącej przedmiotem zainteresowania
• integracja DNA z genomem bakterii lub kolimacja sekwencji DNA w celu istnienia jako plazmid
• selekcja transformowanych E. coli przy użyciu markera selekcyjnego (antybiotyku) (numery katalogowe L5667, L0168, L0543, L0418, L8795)
• ekspansja wybranych E. coli do wyższej skali w odpowiednich podłożach hodowlanych, takich jak klasyczne opcje LB (numery produktów L2542, L3522, L3147) lub EnPresso™ B Growth Systems (numer produktu B11001)
  
• izolacja i oczyszczanie białek wewnątrzkomórkowych/sekrecyjnych

Cechy

• niskokosztowe metody hodowli
• elastyczny system - może przenosić plazmidy z wieloma promotorami, znacznikami i miejscami restrykcji
• łatwy do skalowania i produkowania wyższej wydajności białka

Systemy ekspresji białek drożdżowych - Saccharomyces cerevisiae

Wysoko rozwinięty system genetyczny, łatwość użycia, zmniejszony nakład czasu i kosztów sprawiły, że S. cerevisiae atrakcyjnym organizmem do ekspresji i produkcji rekombinowanych białek. Drożdże są zdolne do przenoszenia specjalnie zaprojektowanych plazmidów, a zdolność ta jest cenna w systemie ekspresji białek rekombinowanych. Zastosowany plazmid składa się z miejsc restrykcyjnych, które można wykorzystać do wstawienia interesującej sekwencji genu. Transformacja drożdży za pomocą plazmidu wytwarza pożądane białko i może być odpowiednio skalowana.

Rysunek 3. System ekspresji białek drożdżowych - Saccharomyces cerevisiae

Ekspresja białka przy użyciu S. cerevisiae obejmuje następujące etapy:

• użycie kompetentnych E. coli do pobrania sekwencji DNA będącej przedmiotem zainteresowania (numery katalogowe  CMC0001, CMC0004, CMC0014)
• integracja DNA z genomem bakterii lub kolistylizacja sekwencji DNA do postaci plazmidu
• selekcja transformowanych E. coli z użyciem markera selekcyjnego (antybiotyku) (numery katalogowe L5667, L0168, L0543, L0418, L8795)
• ekspansja wybranych E. coli w odpowiednich podłożach hodowlanych, takich jak klasyczne opcje LB (numery produktów L2542, L3522, L3147) lub EnPresso™ Y Defined Media (numer produktu Y22001)
  
• izolacja DNA lub plazmidu
• transformacja do drożdży (zestaw do transformacji drożdży, numer katalogowy YEAST1)
• badanie transformantów pod kątem integracji DNA z chromosomem drożdży
• selekcja i skalowanie klonów drożdży o wysokiej ekspresji w odpowiednich podłożach hodowlanych (numery katalogowe Y1375, Y1501, Y1751, Y2001, Y1376, Y0750)
• izolacja i oczyszczanie białek wewnątrzkomórkowych/sekrecyjnych

Features

• niskie koszty metod hodowlanych
• nadaje się zarówno do białek wewnątrzkomórkowych, jak i wydzielanych
• zapewnia eukariotyczną posttranslacyjną glikozylację białek, chociaż skutkuje wysoką

Systemy ekspresji komórek owadzich - Sf9 i Sf21

Linie komórkowe pochodzące od Spodoptera frugiperda, Sf9 i Sf21, są często stosowane jako system ekspresji białek rekombinowanych. Bakulowirus jest litycznym wirusem dsDNA, rutynowo amplifikowanym w komórkach owadów należących do rodziny Lepidoptera. Nie jest on zakaźny dla kręgowców, a jego promotory są nieaktywne w komórkach ssaków.

Rysunek 4. Systemy ekspresji komórek owadzich - Sf9 i Sf21

Ekspresja białka przy użyciu bakulowirusa/komórek owadzich obejmuje następujące etapy:

• użycie kompetentnych E. coli do pobrania sekwencji DNA będącej przedmiotem zainteresowania (numery katalogowe CMC0001, CMC0004, CMC0014)
• integracja DNA z genomem bakteryjnym lub kolimacja sekwencji DNA do postaci plazmidu
• selekcja transformowanych bakterii E. coli przy użyciu markera selekcyjnego (antybiotyku) (numery katalogowe L5667, L0168, L0543, L0418, L8795)
• ekspansja wybranych E. coli w odpowiednich pożywkach hodowlanych (Numery katalogowe L2542, L3522, L3147)
• izolacja DNA lub plazmidu
• przygotowanie drugiego plazmidu zawierającego geny wirusowe wymagane do namnażania i tworzenia cząstek wirusa
• współtransfekcja plazmidu ekspresyjnego i drugiego plazmidu do Sf9 lub Sf21 komórek owadzich
• puryfikacja zrekombinowanego materiału wirusowego
• amplifikacja wirusa i dodatkowa amplifikacja wirusaamplifikacja wirusa i dodatkowe testy płytkowe w celu zwiększenia miana rekombinowanego materiału wirusowego
• infekcja komórek owadzich rekombinowanym materiałem wirusowym o wysokim mianie
• li>izolacja i oczyszczanie wewnątrzkomórkowych/wydzielanych białek

Features

• rekombinowane białko ulega wysokiej ekspresji podczas ostatnich faz cyklu litycznego przed lizą komórki
• odpowiednie do generowania zarówno białek cytoplazmatycznych, jak i wydzielanych
• wiązania dwusiarczkowe w białkach są wydajnie generowane
• zapewniają większość modyfikacji potranslacyjnych występujących w komórkach ssaków

Systemy ekspresji komórek ssaków - HEK293 i CHO

Głównym wyzwaniem związanym z wykorzystaniem komórek ssaków do ekspresji białek rekombinowanych jest zmniejszona wydajność i poziom ekspresji białka. Jednakże, linie komórkowe takie jak HEK293 i CHO zostały opracowane jako wydajne przejściowe i stabilne systemy ekspresji. Komórki HEK293 są przejściowo transfekowane przy użyciu liposomów, fosforanu wapnia lub PEG jako odczynników do transfekcji. Chociaż przejściowa ekspresja jest stosunkowo łatwa i prosta, skalowanie jest technicznym wyzwaniem. Komórki CHO są powszechnie stosowane do stabilnej ekspresji dużych ilości rekombinowanych białek. Proces ten obejmuje transfekcję komórek CHO pozbawionych DHFR interesującym genem i kasetą selekcyjną DHFR. Transfekowane komórki są następnie badane w obecności metotreksatu w celu uzyskania stabilnie transfekowanych puli komórek. Proces selekcji i ekspansji trwa 2-3 miesiące

Rysunek 5. Systemy ekspresji komórek ssaków - HEK293 i CHO

Przejściowa lub stabilna ekspresja białek przy użyciu komórek ssaków obejmuje następujące etapy:

• użycie kompetentnych komórek E. coli do pobrania sekwencji DNA będącej przedmiotem zainteresowania (numery katalogowe  CMC0001, CMC0004, CMC0014)
• integracja DNA z genomem bakteryjnym lub kolimulacja sekwencji DNA do postaci plazmidu
• selekcja transformowanych E. coli przy użyciu markera selekcyjnego (antybiotyku) (Numery katalogowe L5667,&L0168, L0543, L0543. L0418, L8795)
• opcjonalne przechowywanie klonów w CloneStable™
• ekspansja wybranych E. coli w odpowiednich pożywkach (numery katalogowe L2542, L3522, L3147)
• izolacja DNA lub plazmidu
• transfekcja plazmidu ekspresyjnego do komórek ssaków przy użyciu odczynników do transfekcji X-tremeGENE™.
• selekcja stabilnych klonów
• ekspansja klonów do przejściowej ekspresji seryjnej LUB ekspansja klonów przez 2-3 miesiące do stabilnej ekspresji<
• izolacja i oczyszczanie wewnątrzkomórkowych/wydzielanych białek

Features

• ekspresja przejściowa jest łatwa i szybka
• zapewnia wszystkie modyfikacje potranslacyjne występujące w komórkach ssaków
• stabilna transfekcja skutkuje wyższą wydajnością, skalowalnością i powtarzalną produkcją

Następująca tabela porównuje cztery systemy ekspresji białek oraz ich zalety i wady:

System ekspresji białek	Zalety	Wady
E. coli	Szybka ekspresja	Brak eukariotycznych modyfikacji potranslacyjnych
Mniej kosztowne	Niektóre białka nie są prawidłowo sfałdowane
Proste skalowanie procesu	Białka rzadko są wydzielane
Dobrze scharakteryzowana genetyka
S. cerevisiae	Umiarkowanie szybka ekspresja	.Charakterystyczne struktury N-linked glycan białek różnią się w porównaniu do typowych białek ssaków
	Dobrze sprawdza się w przypadku białek wydzielanych i wewnątrzkomórkowych	Wymaga użycia peptydów sygnałowych wydzielania drożdży
	Tańsza	Wymagane są zwiększone środki ostrożności
	.Większość fałdowania białek i modyfikacji potranslacyjnych jest możliwa
Bakulowirus/komórki owadzie	Umiarkowanie szybka ekspresja	Charakterystyczne struktury N-linked glycan białek różnią się w porównaniu do typowych białek ssaków
	Dobrze sprawdza się w przypadku białek wydzielanych, błonowych i wewnątrzkomórkowych	Drogie
	Możliwa jest większość procesów fałdowania białek i modyfikacji potranslacyjnych	Trudne do skalowania
Komórki ssaków (ekspresja przejściowa)	Umiarkowanie szybka ekspresja	Droga
	Działa dobrze dla białek wydzielanych i błonowych	Wydajność białek wewnątrzkomórkowych jest niska
	Możliwe jest składanie wszystkich białek i większość autentycznych modyfikacji potranslacyjnych	Trudne do skalowania
Komórki ssaków (stabilna ekspresja)	Możliwe jest składanie wszystkich białek i większość autentycznych modyfikacji potranslacyjnych	Drogie
	Dobrze sprawdza się w przypadku białek wydzielanych i błonowych	Wydajność białek wewnątrzkomórkowych jest niska
		Trudne do skalowania
		Długi czas ekspresji

Wybierz system ekspresji, który wyraża białko ze wszystkimi pożądanymi modyfikacjami potranslacyjnymi. Niezależnie od wyboru, oferujemy szeroką gamę kompetentnych komórek, owadzich i ssaczych linii komórkowych oraz powiązanych produktów, które pasują do każdego systemu ekspresji białek.