Wykrywanie interakcji białko-białko za pomocą in situ PLA

Wykrywanie interakcji białko-białko za pomocą in situ PLA z Prestige Monoclonals i Prestige Polyclonals

Białka są złożonymi cząsteczkami biologicznymi niezbędnymi dla struktury i funkcji komórkowych. Większość białek powszechnie wchodzi w interakcje z różnymi cząsteczkami, w tym z innymi białkami, w celu pełnienia swoich funkcji. Te interakcje białko-białko są zaangażowane w szeroki zakres procesów komórkowych, w tym np. modyfikacje białek, transport, sygnalizację i cykle komórkowe.

Badania interakcji białkowych mają kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania funkcji białek w kontekście biologii komórki zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym. Dostępnych jest wiele technik oceny interakcji białkowych, takich jak koimmunoprecypitacja, test pulldown, sieciowanie i analiza dalekiego zachodu. Chociaż techniki te zapewniają potężne narzędzia do badania interakcji białek, brakuje im rozdzielczości subkomórkowej możliwej dzięki analizie mikroskopowej natywnych tkanek lub komórek.

A proximity ligation assay (PLA) (Duolink^®) jest techniką, która pozwala na badanie interakcji białko-białko w tkankach lub komórkach in situ (jest PLA).¹ Metoda ta może być stosowana do wykrywania, wizualizacji i kwantyfikacji interakcji białko-białko, jak również do wykrywania poszczególnych białek i modyfikacji białek w komórkach lub skrawkach tkanek.

Dla uzyskania wiarygodnych wyników w teście PLA kluczowy jest wybór przeciwciał pierwotnych. Tylko specyficzne i selektywne przeciwciała umożliwią udaną reakcję PLA. Ogólne wymagania dotyczące przeciwciał pierwotnych są takie, że powinny one należeć do klasy IgG, powinny być oczyszczone przez powinowactwo i powinny być specyficzne dla celu. Ponadto, w celu wykrycia interakcji białko-białko, dwa pierwotne przeciwciała muszą być hodowane w dwóch różnych gatunkach, tj. królika i myszy.

W tym kontekście Atlas Antibodies zapewnia ogromne zasoby pierwotnych przeciwciał, które można wykorzystać do testu PLA. W katalogu dostępnych jest ponad 18000 przeciwciał poliklonalnych (Prestige Polyclonals) i 270 monoklonalnych (Prestige Monoclonals), które łącznie celują w ponad 75% genów kodujących ludzkie białka. Zarówno Prestige Polyclonals, jak i Prestige Monoclonals zostały opracowane przy użyciu starannie zaprojektowanych antygenów. Najwyższy poziom swoistości, powtarzalności i wszechstronności uzyskuje się dzięki unikalnemu procesowi oczyszczania przeciwciał przy użyciu rekombinowanego antygenu jako ligandu powinowactwa dla Prestige Polyclonals. Prestige Monoclonals są oczyszczane na kolumnach z białkiem A. Co ważne, swoistość przeciwciał została potwierdzona przez obszerną analizę IHC w 44 normalnych i 20 nowotworowych tkankach ludzkich.

Jak wspomniano powyżej, główną zaletą PLA w porównaniu z innymi technikami jest możliwość wykrywania interakcji białko-białko z rozdzielczością subkomórkową w natywnych skrawkach tkanek lub komórkach przy użyciu mikroskopii. Może to być szczególnie ważne np. w badaniach nad rakiem, w tym w diagnostyce chorób, stratyfikacji pacjentów i badaniach biomarkerów.²

Staranne rozważenie protokołu utrwalania jest konieczne, aby zapewnić optymalne zachowanie morfologii próbki i docelowego antygenu. Utrwalone w formalinie skrawki tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) zwykle zapewniają optymalne zachowanie morfologii tkanek. Co ważne, wszystkie przeciwciała w katalogu Atlas Antibodies są zwalidowane i zatwierdzone do stosowania w ludzkich (i w niektórych przypadkach gryzoni) próbkach FFPE po odzyskaniu epitopu indukowanego ciepłem.

Zasada PLA in situ

Is PLA³ opiera się na wykorzystaniu przeciwciał znakowanych oligonukleotydami (sond PLA), które generują sygnał tylko wtedy, gdy dwie sondy znajdują się w bardzo bliskiej odległości (około 30 nm). Jedna z sond DNA w utworzonym kręgu DNA służy następnie jako starter dla amplifikacji toczącego się kręgu (RCA) (Rys. 1 A, B). Po dodaniu polimerazy DNA powstaje długi produkt DNA, który pozostaje przyłączony do sondy PLA (Rys. 1 C). Po sfinalizowaniu RCA, konkemeryczne powtórzenia tej samej sekwencji umożliwiają hybrydyzację wielu oligonukleotydów detekcyjnych (Rys. 1 D). Sygnał z każdej wykrytej pary sond PLA jest indywidualną plamką fluorescencyjną, którą można wizualizować pod mikroskopem i określać ilościowo. Sygnały PLA (plamy, plamki) można przypisać do określonej lokalizacji subkomórkowej i określić ilościowo za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, np. BlobFinder.⁴

Rysunek 1. Schematyczny rysunek reakcji PLA. Po inkubacji z pierwotnymi przeciwciałami, inkubować z sondami PLA PLUS i MINUS (A). Hybrydyzacja oligonukleotydów łącznikowych i użycie ligazy do uzupełnienia kręgu DNA (B). Amplifikacja kręgu (C). Hybrydyzacja oligonukleotydów znakowanych fluorescencyjnie w celu wykrycia sygnału (D).

is PLA - krótki protokół

1. Wstępna obróbka tkanek w celu uzyskania optymalnej wydajności przeciwciał (np. HIER, pH=6)
2. Blokowanie
3. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
4. Płukanie
5. Inkubacja sond PLA^® Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37°C.
6. Płukanie
7. Inkubacja ligacji przez 30 min w 37 °C.
8. Amplifikacja Inkubować przez 100 min w 37 °C.
9. Płukanie
10. Przygotowanie do obrazowania

Montaż próbek za pomocą Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI.

Poniżej przedstawiamy trzy przykłady wykrywania interakcji białko-białko w skrawkach tkanek ludzkich FFPE za pomocą PLA z Prestige Monoclonals i Prestige Polyclonals.

Interakcje emeryna-laminy w błonie jądrowej

Powłoka jądrowa oddziela jądro od cytoplazmy, zachowuje integralność strukturalną jądra i kontroluje przejście molekularne między jądrem a cytoplazmą.⁵ Emeryna (EMD) jest białkiem wewnętrznej błony jądrowej, zaangażowanym zarówno w mechaniczną integralność jądra, jak i regulację genów specyficznych dla tkanek.⁶ Laminy jądrowe są głównymi składnikami blaszki jądrowej leżącej u podstaw wewnętrznej błony jądrowej. Działają one jako pomost między wewnętrzną błoną jądrową a chromatyną⁷, zapewniając mechaniczne wsparcie dla otoczki jądrowej, utrzymując właściwą organizację chromatyny i regulację transkrypcji.⁸ Interakcje między emerynami i laminami są ważne dla utrzymania integralności jądrowej.⁹ Mutacje w genach emeryn i lamin powodują patologie znane jako "otoczki jądrowe".¹⁰

W tym przypadku użyliśmy mysiego przeciwciała monoklonalnego AMAb90560 Anti-EMD (1:5000, Rys. 2 A) i królicze przeciwciało poliklonalne Anti- LMNA (HPA006660, 1:30, nie pokazano) lub królicze przeciwciało poliklonalne LMNB1 (HPA050524, 1:150 Rys. 2 B) odpowiednio do wizualizacji interakcji EMD-LMNA (Rys. 2 C) i EMD-LMNB1 (Rys. 2 D) w błonie jądrowej komórek nabłonka płaskonabłonkowego. Zwróć uwagę na czerwony sygnał immunofluorescencji PLA zlokalizowany w obszarze błony jądrowej (Rys. 2 C, D) odpowiadający barwieniu IHC (Rys. 2 A, B). Jądra są kontrbarwione DAPI (Rys. 2 C, D).

Interakcje E-kadheryna - beta-katenina w błonie komórek nabłonkowych

Komórki nabłonkowe służą jako bariery przepuszczalności, oddzielając komórki leżące poniżej od środowiska. Funkcja ta wymaga, aby komórki były ze sobą ściśle połączone. E-kadheryna (CDH1), białko transmembranowe tworzące kompleks z beta-kateniną (CTNNB1), odgrywa kluczową rolę w adhezji komórkowej w komórkach nabłonkowych. Utrata kateniny z pośredniczonych przez kadherynę kontaktów komórka-komórka jest ważnym czynnikiem w procesie przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT).^11,12 Proces EMT został zaproponowany jako ważne zdarzenie w przerzutowym rozprzestrzenianiu się komórek nowotworowych, w którym nabłonkowe komórki nowotworowe uzyskują bardziej ruchliwy i inwazyjny fenotyp i rozprzestrzeniają się z guza pierwotnego.¹³

Tutaj, przeciwciało monoklonalne Anti-CDH1 AMAb90865 (1:1000) i przeciwciało poliklonalne Anti-CTNNB1 HPA029159 (1:600) zostały użyte do wizualizacji interakcji CDH1- CTNNB1 w błonie prawidłowych tkanek nabłonkowych, w tym prostaty (Rys. 3 A) jajowodu (Ryc. 3 B) i okrężnicy (Ryc. 3 C). Zwróć uwagę na silną dodatnią błonę w komórkach nabłonkowych (Ryc. 3 A-C) i brak sygnału PLA w tkance limfatycznej migdałków (kontrola negatywna, Ryc. 3 D). Jądra są barwione DAPI.

Rysunek 2. Barwienie IHC przeciwciałem Anti-EMD AMAb90560 (A) i przeciwciałem Anti-LMNB1 HPA050524 (B) wykazuje wyraźną immunoreaktywność błony jądrowej w komórkach nabłonka skóry. Immunofluorescencja sygnału PLA pokazuje interakcje białko-białko pomiędzy EMD och LMNA (C) i EMD och LMNB1 (D) odpowiednio w błonie jądrowej komórek nabłonka skóry.

Rysunek 3. Immunofluorescencja sygnału PLA pokazuje interakcje białko-białko między CDH1 i CTNNB1 w błonach komórek nabłonkowych prostaty (A), jajowodu (B) i odbytnicy (C). Migdałek został użyty jako kontrola negatywna (D).

Oddziaływanie podokaliksyny i ezryny w błonach kłębuszków nerkowych

Błona plazmatyczna komórki zawiera wiele rodzajów białek, zaangażowanych m.in. w utrzymanie struktury komórki, transport przezbłonowy i transdukcję sygnału. Białko podobne do podokaleksyny (PODXL) jest transbłonowym białkiem sialomucynowym o właściwościach antyadhezyjnych. W normalnej nerce funkcją PODXL jest utrzymywanie otwartej ścieżki filtracji między sąsiednimi wyrostkami stopy w podocycie. Wykazano również, że PODXL odgrywa rolę w rozwoju i agresywności raka^14-17, przynajmniej częściowo poprzez interakcję z białkiem wiążącym aktynę ezrinem (EZR).^18,19

Zarówno PODXL, jak i EZR ulegają ekspresji w prawidłowych błonach kłębuszków nerkowych, a także w nabłonku rzęskowym jajowodu. Tutaj pokazujemy interakcję tych białek za pomocą PLA, stosując przeciwciało monoklonalne anty-PODXL AMAb90644 (1:5000) i przeciwciało poliklonalne anty-EZR HPA021616 (1:2500). Zwróć uwagę na silny sygnał PLA w błonie kłębuszków nerkowych (Ryc. 4 A, B), a także w błonach wierzchołkowych komórek nabłonkowych jajowodu (Ryc. 4 C). Wątroba została użyta jako kontrola negatywna (Ryc. 4 D). Jądra są wybarwione DAPI.

Rysunek 4. Sygnał PLA immunofluorescencji pokazuje interakcje białko-białko między PODXL i EZR w błonach kłębuszków nerkowych (A i B), a także w nabłonku rzęskowym jajowodu (C). Zwróć uwagę na brak sygnału PLA w kanalikach nerkowych (A, B), a także w leżącej poniżej tkance łącznej jajowodu (C). Wątroba została użyta jako kontrola negatywna (D).

Podsumowanie

Przedstawione dane pokazują, w jaki sposób Prestige Polyclonals i Prestige Monoclonals mogą być wykorzystywane do wykrywania interakcji białko-białko w ludzkich tkankach in situ wykorzystując potężną technikę PLA. Badania oparte na takich danych mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia funkcji białek w stanach normalnych i patologicznych.

Referencje

1. Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Östman A, Landegren U. 2002. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20(5):473-477. https://doi.org/10.1038/nbt0502-473

2. Blokzijl A, Friedman M, Pontén F, Landegren U. Profiling protein expression and interactions: proximity ligation as a tool for personalized medicine. 268(3):232-245. https://doi.org/10.1111/j.1365-2796.2010.02256.x

3. Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius K, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson L, et al. 2006. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3(12):995-1000. https://doi.org/10.1038/nmeth947

4. Allalou A, Wählby C. 2009. BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 94(1):58-65. https://doi.org/10.1016/j.cmpb.2008.08.006

5. Gerace L, Burke B. 1988. Functional Organization of the Nuclear Envelope. Annu. Rev. Cell. Biol.. 4(1):335-374. https://doi.org/10.1146/annurev.cb.04.110188.002003

6. Yorifuji H, Tadano Y, Tsuchiya Y, Ogawa M, Goto K, Umetani A, Asaka Y, Arahata K. 1997. Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane. neurogenetics. 1(2):135-140. https://doi.org/10.1007/s100480050020

7. Ciska M, Moreno Díaz de la Espina S. The intriguing plant nuclear lamina. Front. Plant Sci.. 5 https://doi.org/10.3389/fpls.2014.00166

8. Luperchio TR, Wong X, Reddy KL. 2014. Genome regulation at the peripheral zone: lamina associated domains in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 2550-61. https://doi.org/10.1016/j.gde.2013.11.021

9. Sakaki M, Koike H, Takahashi N, Sasagawa N, Tomioka S, Arahata K, Ishiura S. 2001. Interaction between Emerin and Nuclear Lamins. Journal of Biochemistry. 129(2):321-327. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jbchem.a002860

10. Muchir A, Worman HJ. 2007. Emery-Dreifuss muscular dystrophy. Curr Neurol Neurosci Rep. 7(1):78-83. https://doi.org/10.1007/s11910-007-0025-3

11. Wever O, Pauwels P, Craene B, Sabbah M, Emami S, Redeuilh G, Gespach C, Bracke M, Berx G. 2008. Molecular and pathological signatures of epithelial?mesenchymal transitions at the cancer invasion front. Histochem Cell Biol. 130(3):481-494. https://doi.org/10.1007/s00418-008-0464-1

12. Stemmer V, de Craene B, Berx G, Behrens J. 2008. Snail promotes Wnt target gene expression and interacts with ?-catenin. Oncogene. 27(37):5075-5080. https://doi.org/10.1038/onc.2008.140

13. Christiansen JJ, Rajasekaran AK. 2006. Reassessing Epithelial to Mesenchymal Transition as a Prerequisite for Carcinoma Invasion and Metastasis. Cancer Res. 66(17):8319-8326. https://doi.org/10.1158/0008-5472.can-06-0410

14. Casey G, Neville PJ, Liu X, Plummer SJ, Cicek MS, Krumroy LM, Curran AP, McGreevy MR, Catalona WJ, Klein EA, et al. 2006. Podocalyxin variants and risk of prostate cancer and tumor aggressiveness. 15(5):735-741. https://doi.org/10.1093/hmg/ddi487

15. Larsson A, Johansson ME, Wangefjord S, Gaber A, Nodin B, Kucharzewska P, Welinder C, Belting M, Eberhard J, Johnsson A, et al. 2011. Overexpression of podocalyxin-like protein is an independent factor of poor prognosis in colorectal cancer. Br J Cancer. 105(5):666-672. https://doi.org/10.1038/bjc.2011.295

16. Binder ZA, Siu I, Eberhart CG, ap Rhys C, Bai R, Staedtke V, Zhang H, Smoll NR, Piantadosi S, Piccirillo SG, et al. Podocalyxin-Like Protein Is Expressed in Glioblastoma Multiforme Stem-Like Cells and Is Associated with Poor Outcome. PLoS ONE. 8(10):e75945. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0075945

17. Boman K, Larsson AH, Segersten U, Kuteeva E, Johannesson H, Nodin B, Eberhard J, Uhlén M, Malmström P, Jirström K. 2013. Membranous expression of podocalyxin-like protein is an independent factor of poor prognosis in urothelial bladder cancer. Br J Cancer. 108(11):2321-2328. https://doi.org/10.1038/bjc.2013.215

18. Orlando R. 2001. The glomerular epithelial cell anti-adhesin podocalyxin associates with the actin cytoskeleton through interactions with ezrin.. J Am Soc Nephrol. 12(8):1589–1598.

19. Sizemore S, Cicek M, Sizemore N, Ng KP, Casey G. 2007. Podocalyxin Increases the Aggressive Phenotype of Breast and Prostate Cancer Cells In vitro through Its Interaction with Ezrin. Cancer Research. 67(13):6183-6191. https://doi.org/10.1158/0008-5472.can-06-3575